I microarray o biochips sono un piccolo supporto per analisi costituito, nella forma più tradizionale, da un vetrino portaoggetti o anche altri tipi di supporto su cui sono fissati, su linee parallele, decine, centinaia o anche migliaia di puntini (spots) che sono piccoli o addirittura piccolissimi ammassi di acidi nucleici, proteine o cellule e che quindi, funzionando da veri e propri biosensori, rendono possibile, con l'aiuto del computer, la valutazione di qualsiasi tipo di fenomeno vitale con una velocità e una precisione mai realizzate in precedenza in tutta la storia della biologia. Un biosensore, infatti, è un sensore chimico che sfrutta l'elevata specificità e sensibilità delle molecole biologiche per trasformare un segnale biochimico ( in genere un evento di riconoscimento specifico ) in un segnale quantificabile.

Praticamente il microarray è un miniaturizzato sistema di analisi che si basa sulla utilizzazione di supporti di vario genere, i più comuni sono in vetro, su cui sono allineate microscopiche aree costituite da un numero anche notevole di molecole di cattura, disposte secondo specifici criteri, che rendono possibile, per mezzo di indicatori fluorescenti o di altro genere, determinare in parallelo, e nello stesso tempo, anche migliaia di eventi biologici che, letti da uno scanner in parallelo e contemporaneamente o da altro apparecchio in grado di assolvere alla stessa funzione, sono resi evidenti sullo schermo di un computer, che tra l' altro, in base ai risultati, può anche dare una risposta numerica che è espressione della elaborazione complessiva del fenomeno preso in esame.

La utilizzazione di tali piccolissime quantità di molecole di cattura, e di altrettanto piccole quantità dei campioni, rende il metodo molto più sensibile di altri che utilizzano volumi centinaia di volte maggiori.

Pertanto, proprio per le sue peculiari caratteristiche, l'uso dei microarray ha trovato immediata larga applicazione nello studio del genoma in quanto è stato possibile utilizzare vetrini su cui erano stati fissati anche decine di migliaia di oligonucleotidi per centimetro quadrato e che quindi, in base a specifici fenomeni di ibridazione, permettevano di mettere insieme rapidamente, ed in parallelo, una enorme quantità di dati sull' espressione dei singoli geni.

La prima intuizione di tale nuovo metodo di analisi la si deve a Mark Schena dell’università di Stanford, che ne ha fatto cenno ad Amsterdam nel 1994 nel corso del quarto congresso internazionale di Biologia Molecolare delle Piante, ma la prima pubblicazione riguardante questa nuova tecnica è dell'anno seguente (Schena et al. 1995). Presso l'università di Stanford, che ha una lunga tradizione negli studi sugli acidi nucleici, e presso i contigui Laboratori Davis, sono state infatti affrontate le prime problematiche su come fissare sui vetrini microscopiche linee di sequenze di geni delle piante e su come studiarne l'espressione utilizzando campioni di mRNA isolati dalle cellule e coniugati ad un enzima per poter evidenziare poi l'avvenuta reazione con la comparsa di fluorescenza di intensità variabile e quindi misurabile.

Quindi i microarray, come i microprocessori, sono nati nella Silicon Valley. Parallelismo, miniaturizzazione ed automazione sono tre aspetti che mettono in luce una certa similarità fra le due tecnologie. I microprocessori hanno rivoluzionato i rapporti umani ed hanno reso possibile favorire gli interscambi ed eseguire milioni di calcoli per secondo. Abbiamo il convincimento che i microarray potranno generare una rivoluzione tecnologica di inimmaginabile portata, perché in grado di chiarire tantissimi problemi che sono alla base dei processi che riguardano tutte le forme di vita sia vegetale che animale.

Infatti si è sviluppato rapidamente un enorme interesse sulle prospettive di utilizzazione di tale nuova tecnologia perché utilizzabile non solo per studiare le piante, gli animali e l' uomo, ma anche i lieviti, i batteri, i virus. Ne consegue che si intravede un' esplosiva applicazione non solo in medicina ma in tutta la biologia, agricoltura compresa.

Per avere un' idea di quello che può rappresentare in campo medico basti pensare che l'espressione dei singoli geni è sempre strettamente correlata a quasi tutti i fenomeni della crescita, dello sviluppo, dell'invecchiamento, all'azione delle droghe, degli ormoni, alle malattie mentali e ad una infinità di malattie in cui la sequenza genica del singolo individuo gioca un ruolo importante.

Ci si è subito resi conto che, con questo nuovo mezzo d'indagine, sarebbe stato possibile non solo fare diagnosi molto più precise e documentate, ma anche sarebbe stato possibile arrivare alla individuazione dei farmaci più adatti da utilizzare di volta in volta per i singoli pazienti.

Siamo quindi alla vigilia di un modo nuovo di fare la medicina su basi biologiche molto più complete e profonde perché potremo valutare rapidamente, grazie all'uso dei microarray e dei computer, non solo il comportamento dei singoli organi o distretti, ma anche essere informati di quello che è in atto in base alla valutazione dell'attività di migliaia di singoli componenti cellulari, inclusi i geni che ci daranno la possibilità di fare diagnosi esatte, anche in corso di manifestazioni patologiche di difficile interpretazione, compresi i tumori.

Dato che nel genoma di ciascuno di noi c'è scritto chi siamo e quello che possiamo o non possiamo fare, e dato che la nostra vita è espressione delle interreazioni che, specialmente attraverso le proteine, che derivano dai geni, avvengono fra le nostre cellule, con i microarray, sapremo dare risposte precise a tante domande a cui oggi non è possibile rispondere.

Ma questa nuova tecnologia, se da un lato si va diffondendo perché permette di realizzare tecniche diagnostiche finora improponibili, è ancora abbastanza complessa perché, per lo meno sotto certi apetti, alcune fasi non hanno ancora raggiunto l’optimum di standardizzazione e di automazione. I problemi che si possono affrontare sono tali e tanti che non ci si deve meravigliare se alcuni aspetti o alcuni tipi di soluzioni che sono prospettati possono far sorgere dei dubbi.

Lo scopo di questa monografia è pertanto sia quello di descrivere le tecniche fondamentali e le possibili applicazioni ma anche di illustrare tutti gli aspetti riguardanti i controlli di qualità che in tipo di lavoro così complesso, che è ancora in gran parte di tipo artigianale e molto capillarizzato assumono più che mai un’importanza determinante per ottenere consistenza e ripetibilità di risultati.

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CAPITOLO UNO

LE BASI CHIMICHE DELLA VITA

L'essenza della vita è un colossale ed apparentemente disordinato rimescolamento di molecole che interagiscono in rete per effetto degli stimoli dell’ambiente con diversi gradi di connettività e differenti stati di sensibilità alle perturbazioni.

Le molecole sono sostanze formate da due o più atomi combinati in vario modo. Atomi della stessa specie e della stessa massa formano la tavola periodica dei 118 elementi che è praticamente l'alfabeto chimico. Gli elementi sono quindi atomi che, con le normali reazioni chimiche non possono essere frazionati in strutture più semplici.

I vari elementi sono identificati usando o l'intero nome o lettere singole: Carbonio (C), azoto (N), ossigeno (O), fosforo (P) e zolfo (S) sono gli elementi che più di frequente si trovano nelle biomolecole.

Lo studio delle basi chimiche della vita si articola nella biochimica, disciplina scientifica sviluppatasi negli ultimi 200 anni, che ha svelato, con una impressionante serie di progressive scoperte, il funzionamento delle più importanti molecole che giocano un ruolo fondamentale nei meccanismi vitali e che sono il DNA, RNA, le proteine ed i carboidrati.

Queste sono strutture allungate,conosciute anche come biopolimeri, e che sono composte da catene di molecole più piccole o monomeri. I più importanti monomeri, su cui si articolano i meccanismi fondamentali della vita, sono i nucleotidi, gli aminoacidi ed i monosaccaridi.

Cerchiamo di ricapitolare brevemente le caratteristiche fondamentali di ciascuno di essi.

NUCLEOTIDI

Sono i monomeri o molecole costituenti le catene degli acidi nucleici sia tipo DNA che RNA, e consistono, a loro volta di tre differenti componenti: una base azotata, un gruppo fosfato ed una molecola di zucchero o monosaccaride.

Le basi azotate sono strutture eterocicliche contenenti più atomi di azoto ed una delle cinque basi azotate che sono note come adenina ( A ), guanina ( G ), citosina ( C ), timina ( T ) ed uracile ( U). Sono appunto dette basi perché in soluzione hanno reazione basica. Come vedremo, le prime quattro entrano nella struttura del DNA o acido desossiribonucleico, mentre l'uracile, invece della timina, entra nella struttura del RNA o acido ribonucleico.

Oltre alle basi, la molecola del nucleotide è composta anche da una molecola di un monosaccaride a 5 atomi di carbonio detto appunto pentosio. Le molecole del monosaccaride dei nucleotidi del DNA e quelle del RNA sono praticamente identiche tranne che in posizione 2' dell'anello che contiene, per il DNA, un atomo di idrogeno e quindi H, invece dell'ossidrile OH che è nella stessa posizione del RNA. Da ciò derivano pertanto le denominazioni desossiribosio e ribosio.

I nucleotidi che compongono la molecola di DNA e RNA contengono una sola molecola di fosfato mentre quelli utilizzati per la sintesi enzimatica sempre del DNA e RNA ne contengono tre.

AMINOACIDI

Sono i componenti essenziali delle proteine e, come tali, indispensabili alla vita. Svolgono un ruolo importantissimo in vari processi chimici naturali.

Gli aminoacidi sono 20 e tutti hanno come componenti caratteristici della struttura sia una gruppo amminico ( NH3 ) che un gruppo carbossilico ( COO ) acido da cui deriva il nome. Riportiamo nella seguente tavola come vengono contrassegnati in modo abbreviato con tre lettere o con una singola lettera.

TAVOLA DEGLI AMINOACIDI

Aminoacidi	Abbreviazione a tre lettere	Abbreviazione a lettera singola
Alanina	ala	A
Arginina	arg	R
Asparagina	asn	N
Aspartato	asp	D
Cisteina	cys	C
Glutamina	gin	Q
Glutammato	glu	E
Glicina	gly	G
Istidina	his	H
Isoleucina	ile	I
Leucina	leu	L
Lisina	lys	K
Metionina	met	M
Fenilalanina	phe	F
Prolina	pro	P
Serina	ser	S
Treonina	thr	T
Triptofano	trp	W
Tirosina	tyr	Y
Valina	val	V

Si sospetta che nelle prime forme di vita, gli archeobatteri, il codice usato non arrivasse a specificare tutti e 20 questi elencati ma ce ne fossero altri due: la selenocisteina e la pirrolisina, che sono simili alla serina. Questo ci fa pensare che il codice genetico, non sia stato sempre uguale ma che tenda ad evolvere e ad espandersi dando origine a nuovi aminoacidi.

MONOSACCARIDI

Sono composti biochimici noti anche come zuccheri. altamente solubili, contenenti atomi di carbonio, idrogeno e ossigeno in rapporto 1: 2 : 1. E' una famiglia di molecole molto estesa che include glucosio, fruttosio, mannosio, galattosio ecc.

Le catene di monosaccaridi contenenti due o più di tali molecole sono conosciuti come polisaccaridi o carboidrati.

DNA

Il DNA o acido desossiribonucleico è presente nel nucleo di ogni cellula del nostro corpo. E’ la molecola di cui sono composti i geni e che codifica le informazioni per la sintesi sia dell’ RNA che delle proteine. E’ composta da tre componenti: uno zucchero,un fosfato, ed una base. La molecola del DNA è lineare e si forma per un’ azione enzimatica che lega il gruppo idrossilico 3' di un nucleotide al gruppo S' del fosfato di un altro nucleotide. Due nucleotidi riuniti insieme in questo modo formano un dinucleotide, ma le molecole di DNA sono formate da un gran numero di nucleotidi. Risultano essere, quindi, sottili e lunghissime scale a chiocciola ma avvolte e superavvolte in un'intelaiatura proteica, così che il tutto assume la forma di un bastoncello microscopico che prende il nome di cromosoma, che, come vedremo è composto da un insieme di segmenti funzionali, detti geni.

Un tipico gene umano contiene spesso circa 10.000 nucleotidi, mentre un cromosoma ne contiene anche 1.000.000.

La catena del DNA ha una polarità e viene letta andando da sinistra, o parte alta, verso destra che è la parte terminale. La parte alta contiene il fosfato legato all'atomo S' di carbonio del desossiribosio, mentre l'estremo terminale contiene il gruppo idrossilico legato all' atomo 3' di carbonio del desossiribosio.

Le molecole di DNA si possono sintetizzare usando particolari macchine che, appunto, prendono il nome di sintetizzatori di DNA. Si possono così realizzare delle catene di 10-100 nucleotidi a catena singola, noti come oligonucleotidi sintetici, largamente utilizzati anche nella produzione dei microarray.

Le molecole di DNA naturale, essendo le catene singole instabili, sono bicatenarie e le singole catene, distanti l'una dall'altra 20 Å, sono tenute insieme da ponti idrogeno che gli danno un andamento a spirale come in una scala a chiocciola e con le singole volute corrispondenti a 10 basi. Una catena va dal 5' al 3' e l'altra, che è complementare dal 3' al 5'. L'accoppiamento delle due catene si realizza sempre con collegamenti esclusivi, nel senso che all'adenina (A) si lega alla timina (T), e la guanina (G) si lega alla citosina (C). Questo processo di interreazione fra le due catene complementari prende il nome di ibridazione.

L’unità fondamentale del codice genetico è il codone che è composto da tre nucleotidi.

Le molecole di DNA, come dimostrato da Watson e Crick, sono costituite da un doppio filamento di nucleotidi appaiati perfettamente complementari. Si tratta di molecole filiformi e lunghissime, avvolte a gomitolo e quindi tridimensionali, di carica negativa, facilmente solubili in acqua, grazie alla presenza del fosfato e dello zucchero che sono altamente idrofilici.

Si tratta perciò di molecole con cui è relativamente facile lavorare in laboratorio. La carica negativa, conferita dal fosfato, ne facilita il legame sulle superfici dei microarray quando queste sono rese di carica positiva trattandole per es. con derivati amminici ( R-NH 3+ ).

RNA

Le molecole di RNA sono molecole intermediarie perché, come mRNA, ovvero RNA messaggero, trasferiscono l'informazione genetica dal DNA alle proteine che devono essere sintetizzate, e come t RNA, ovvero RNA trasportatore, raccolgono nel citoplasma e mettono in fila, presso i ribosomi, i vari aminoacidi in modo che formino la sequenza proteica prevista in base al segnale che arriva dal DNA. Sono molecole simili a quelle del DNA ma hanno alcune particolarità, perché sono a catena singola, contengono la base uracile ( U ) invece che la timina ( T ) ed hanno come molecola di zucchero il ribosio invece che il desossiribosio.

Le catene di RNA, oltre che essere singole, sono molto più corte nel senso che non superano mai i 10.000 nucleotidi. Anche queste molecole sono dotate di carica negativa, facilmente solubili ma molto più instabili rispetto a quelle del DNA, perché facilmente attaccate dalle ribonucleasi che sono enzimi molto diffusi nell' ambiente e sulle superfici del nostro corpo per cui, quando ci si lavora bisogna prendere particolari precauzioni ed indossare guanti di gomma sintetica.

La maggior parte dei ricercatori riconoscono tre tipi di RNA cellulari: messaggero ( m RNA ), ribosomiale ( r RNA ) e di trasferimento ( t RNA ). Le molecole di m RNA,che sono appunto quelle devolute al trasferimento dell'informazione genetica, non superano il 5% del RNA totale cellulare, ma, sotto il profilo funzionale, sono le più importanti, perché ciascuna molecola di m RNA corrisponde, come sequenza di basi, ad uno specifico gene. Pertanto siccome i geni umani sono circa 30.000, ci sono 30.000 differenti molecole di mRNA nelle nostre cellule, ciascuna formata da una catena di 1000-10.000 ribonucleotidi.

Sono le molecole di r RNA le più abbondanti ( fino al 85% del totale ), ciascuna comprendente 100-5000 ribonucleotidi, che sono quelle che coordinano direttamente la sintesi delle proteine che avviene proprio a livello dei ribosomi, che sono larghe strutture citoplasmatiche devolute a questa funzione.

Le t RNA, che costituiscono circa il 10% del totale, hanno la funzione di legare i singoli aminoacidi al m RNA per rendere possibile poi il trasferimento ai ribosomi e favorire così la sintesi delle proteine.

Ma si va facendo strada il sospetto che esista un quarto tipo di RNA, che si potrebbe chiamare RNA attivo, cosi chiamato perché sembra che simuli proprio la funzione dei geni, tanto che qualcuno comincia a parlare di geni di solo RNA ( Eddy 200 l; Storz 2002 ), le cui funzioni, ancora parzialmente definite, cercheremo di chiarire più in avanti.

PROTEINE

Il dogma centrale su cui si è basata la genetica molecolare, a partire dagli anni cinquanta, è molto semplice: Il DNA fa l' RNA, l' RNA fa le proteine e le proteine svolgono quasi tutto il lavoro biologico vero e proprio.Più esattamente possiamo dire che i geni sono codificati nel DNA del nucleo delle cellule. Qui è prodotto ( trascritto) lo RNA messaggero ( m RNA ) che si trasferisce nel citoplasma, elimina gli introni , subisce una serie di modificazioni e, poi, con l’aiuto dei ribosomi, ciascuno viene tradotto nella relativa proteina.

Le proteine sono composte da lunghe catene di centinaia o migliaia di aminoacidi , legati insieme con legami covalenti fra il gruppo carbossilico di un aminoacido ed il gruppo amminico del contiguo.

Abbiamo visto che esistono 20 aminoacidi con formule chimiche diverse, e, quindi, una serie di componenti elementari molto più numerosi dei quattro nucleotidi che formano le molecole del DNA e del RNA. Ne deriva che, legandosi in vario modo possono dar luogo a lunghissime catene diverse che costituiscono poi la struttura di tutto il mondo biologico sia vegetale che animale.

Quando una proteina si forma si ripiega in una struttura tridimensionale che è per lo più determinata dall'affinità degli aminoacidi per l'acqua. Gli aminoacidi idrofobi tendono a ripiegarsi all'interno della molecola, lasciando le loro controparti idrofile, come per esempio il glutammato nella molecola dell' emoglobina, a contatto con il citoplasma acquoso della cellula.

Nelle cellule la trasmissione del messaggio dal DNA al RNA e poi alla proteina, avviene in modo collineare sequenziale:

5' -CAC-TTT-GTA-3' DNA

5' -CAC -UUU -GUA -3' RNA

H3N -his -phe -val -COO Proteina

Ognuno dei circa 30.000 geni umani dovrebbe codificare una sola proteina e, quindi, nelle nostre cellule ci dovrebbero essere circa 30.000 proteine diverse. Invece la realtà è molto più complessa perché si è visto che ciascun gene può codificare fino a 20 proteine diverse e che di molte proteine si conoscono più varianti, simili ma diverse o per la sostituzione di qualche aminoacido o per una diversa configurazione della forma terziaria derivante dal ripiegamento. Le proteine sono quindi una vastissima famiglia di molecole comprendenti enzimi, anticorpi, ricettori, trasportatori, ormoni ecc. Pertanto oggi si ritiene che il proteoma umano comprenda non meno di un milione di molecole diverse.

Gli enzimi, come è noto, sovrintendono a tutte le attività biologiche quali la sintesi del DNA, la sintesi del RNA, la sintesi delle proteine, il metabolismo cellulare in tutte le sue forme, la degradazione del RNA, la degradazione delle proteine ecc.

Si sa che nel nostro organismo i vari enzimi catalizzano, nelle cellule, centinaia e anche migliaia di reazioni biochimiche al secondo.

Gli anticorpi sono invece molecole di difesa che servono a proteggerci dall’invasione di virus, batteri, e da molti tipi di molecole estranee che penetrano nei nostri tessuti, che prendono il nome di antigeni.

Gli anticorpi sono globuline che, in base al peso molecolare si dividono in due grandi categorie: quelli di peso molecolare compreso fra 150.000 e 190.000 e quelli di peso molecolare intorno a 900.000- Alla prima categoria appartengono quattro classi IgA, IgD, IgE ed IgG. Alla seconda soltanto le IgM.

Già alla nascita sono presenti nei nostri tessuti anticorpi di origine materna, trasmessi attraverso la placenta e, nei primi giorni di vita, attraverso il colostro. Col tempo compaiono poi gli anticorpi che poi, in ciascuno di noi, si formano come risposta ad antigeni ambientali o ad infezioni o per effetto di immunizzazioni indotte da vaccini. Caratteristica fondamentale degli anticorpi è quella di reagire in modo specifico con l' antigene che ne ha determinato la formazione. Sono pertanto noti anche come immunoglobuline.

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CAPITOLO DUE

EREDITÁ E RETI DINAMICHE

GENI

Il gene è un segmento del DNA genomico ed è quindi l'unità morfologica funzionale dell'intero organismo. Il luogo fisico dove ciascun gene è posizionato è detto locus. In ogni locus possono esistere forme diverse dei geni, perché, eccetto per i cromosomi del sesso, ogni individuo ha due alleli per ciascun locus.Tali alleli sono analoghi ai “ fattori “ descritti da Mendel. Gli individui sono omozigoti, per ogni aspetto morfologico o funzionale, se i due alleli sono identici e, quindi, indistinguibili l’uno dall’altro. Gli eterozigoti hanno invece alleli diversi. I maschi sono emizigoti perché hanno una sola copia del cromosoma X.

La differenza fra i due alleli può essere minima, ossia riguardare una sola coppia di basi. Alcune volte la non corrispondenza degli alleli non ha conseguenze funzionali mentre altre volte, come vedremo, anche la diversità di una sola base, può avere effetti deleteri, come nel caso dell’anemia a cellule falciformi dovuta ad un’accoppiamento timina-alanina che porta all’alterazione della ctena B dell’emoglobina A, perché la sostituzione di un’aminoacido idrofilo con uno idrofobo fa cambiare la struttura terziaria. Quando gli alleli sono diversi, in genere, uno prevale sull’altro, e pertanto è detto dominante.

Ciascun gene codifica un solo tipo di m RNA ed una sola proteina, seppure con diverse varianti strutturali, ed, attraverso di essi impartisce istruzioni al funzionamento della cellula. Gruppi di geni adiacenti svolgono spesso funzioni correlate. Ma i geni non funzionano tutti nello stesso tempo. Ad esempio i geni che controllano il metabolismo del lattosio funzionano solo quando una cellula cresce in un terreno contenente, come zucchero essenziale, il lattosio. In assenza di lattosio non hanno bisogno di lavorare.

Ogni gene è composto da circa 10.000 nucleotidi, ovvero l0 kb o chilobasi, che sono disposti in modo da formare la doppia elica di acido desossiribonucleico ( DNA ).

I geni degli eucarioti, e quindi anche delle cellule umane, contengono un certo numero di esoni e di introni.

Gli esoni sono segmenti di gene che vengono copiati sul corrispondente m RNA e sono composti da sequenze di codoni ovvero da sequenze delle 64 triplette di nucleotidi contenenti le quattro basi A T C G, ciascuna riferentesi ad uno dei 20 aminoacidi utilizzati per la sintesi delle proteine. Ma, con eccezione per metionina e triptofano, anche triplette diverse possono codificare per lo stesso aminoacido, per esempio quattro codoni codificano la leucina ( CTT, CTC, CT A, CTG ), e due la lisina ( AAA, AAC ).

Introni sono invece segmenti di geni che non vengono trasferiti nel m RNA e che quindi non codificano la sintesi delle proteine. Queste porzioni di sequenze non codificanti, che costituiscono oltre l’80% del genoma umano, non sono tuttavia inutili, come si è creduto per molti anni, perché, come vedremo, danno origine a RNA sorprendentemente attivi, in grado di silenziare o regolare i geni.

Un tipico gene umano è costituito da 6-8 esoni ed introni, ciascuno lungo 100-1000 paia di basi e, quindi, 0,1-1 kb. Ma la lunghezza e la struttura dei geni varia considerevolmente. Per esempio il gene che determina la fibrosi cistica, malattia che, in alcune aree, colpisce 1 neonato ogni 3000, contiene 25 esoni e ben 250 kb che codificano una proteina patologica di ben 1480 aminoacidi.

Il più grande gene umano noto è quello che determina la distrofia muscolare di Duchenne: contiene 75 esoni e 2,4 milioni di paia di basi.

E' interessante il punto di vista dello zoologo inglese Richard Dawkins che, nel riconsiderare i concetti di gene, individuo e specie ha affermato che l'organismo deve essere visto nella sua interezza come una macchina le cui parti concorrono a realizzare un unico fine che consiste nella replicazione di tutti i geni dell'organismo. Ogni organismo si è sviluppato grazie ad un patto stabilito fra loro dai geni che sono sopravvissuti proprio in virtù della propria capacità di collaborare nel pool genetico per creare organismi individuali dello stesso tipo. In quest'ottica i geni rappresentano i veri replicatori, mentre l'organismo è semplicemente il veicolo per il replicatore e la specie è l'agglomerato nel quale i geni collaborano tra loro perché presentano le stesse aspettative. I replicatori sopravvivono attraverso il processo di selezione naturale in virtù della loro compatibilità con l'ambiente.

GENOMA

Si intende l'insieme di tutto il materiale genetico che costituisce il corredo ereditario di un organismo vivente. Ogni cellula di un organismo contiene nel proprio nucleo un insieme di coppie i di cromosomi costituiti da DNA e da proteine. Per esempio ogni cellula umana contiene nel proprio nucleo 46 cromosomi, 23 di origine paterna e 23 di origine materna e più precisamente 22 autosomi , che sono uguali nel maschio e nella femmina e poi X ed Y che sono i cromosomi del sesso che sono morfologicamente diversi.

Le cellule somatiche degli animali superiori sono dette diploidi perché hanno due copie di ciascun cromosoma che, come abbiamo visto, sono di origine diversa, una dal padre ed una dalla madre. Invece le cellule dell’uovo o dello sperma per ciascun cromosoma hanno un unico rappresentante e, quindi, sono dette aploidi.

Se si colorano le cellule in fase di divisione si possono vedere al microscopio i singoli cromosomi, che sonodistinguibili per la grandezza ed in base alla morfologia caratterizzata dalla posizione del centromero che è interposto fra le braccia corte ( p ) e le braccia lunghe ( q.).

All'interno dei cromosomi risiedono i geni distribuiti l'uno dopo l'altro in modo da formare un filamento attorcigliato lungo circa 2 metri e che, codificando la produzione delle proteine, nel loro complesso, determinano tutte le caratteristiche dell' organismo. Ogni specie di organismi ha un certo numero di cromosomi e di geni che sono caratteristici per la specie perchè ne differenziano l'aspetto, il metabolismo ed il comportamento rispetto a quelli di altre specie. Quindi ciascun organismo ha un'unica sequenza ed un'unica struttura del genoma che, entro certi limiti è abbastanza stabile, e che è caratteristica per ogni forma di vita e questo si verifica a tutti i livelli della scala biologica.

I geni degli organismi unicellulari primordiali e le cellule batteriche, che hanno preceduto di miliardi d'anni la comparsa dell'uomo sulla terra, avevano un genoma più semplice e privo di introni e i cui codoni sequenziavano un numero più ridotto di aminoacidi. Invece gli organismi unicellulari attuali come i lieviti, hanno nucleotidi ed aminoacidi simili a quelli umani, che, da un lato, confermano la teoria evolutiva degli esseri viventi, che va dai più semplici fino all'uomo, ma sono geni con strutture geniche più piccole e prive di introni.

Il genoma di molti virus e batteri consiste di un singolo cromosoma circolare, mentre gli organismi superiori hanno un genoma composto da numerosi cromosomi lineari.

Man mano che si sale nella scala biologica si vede che il numero dei geni e quello dei cromosomi aumenta e la struttura diventa più complessa. Quello che già si sospettava lo ha confermato la completa identificazione delle sequenze genomiche ormai completa per circa 1000 organismi diversi, che è stata estesa, negli ultimi anni anche all'uomo.

Gli obiettivi principali del Progetto Genoma Umano, che ha avuto fra i promotori James Watson e l'italiano Renato Dulbecco e che, con inzio nel 1984, ha coinvolto numerosi laboratori non solo in USA, ma anche in Francia, Inghilterra, Italia, Russia e Giappone, è stato quello di identificare la posizione di ciascun gene nei cromosomi umani e stabilire la sequenza con cui si succedono i nucleotidi dei singoli geni e quindi leggere per la prima volta l’intero libro d’istruzioni per costruire e far funzionare l’organismo umano contenute nel nostro DNA. Simultaneamente il Progetto ha dato la possibilità di confermare che l'evoluzione ha preservato in esseri viventi molto diversi fra loro, numerosi geni che hanno funzioni simili.

Comunque ogni specie di organismi ha un certo numero di cromosomi e di geni caratteristici e, poi, all'interno di ciascuna specie, ogni individuo ha un proprio genoma specifico.

Notiamo infatti che, per esempio, la mosca della frutta ( Drosophila melanogaster ) ha 5 cromosomi, 14.000 geni e 140.000.000 paia di basi; il topo ha 20 coppie di cromosomi, 30.000 geni e 3.000.000.000 paia di basi; l'uomo ha 3 coppie di cromosomi più del topo, ma, all'incirca, lo stesso numero di geni e di paia di basi.

E' stato messo in evidenza che il genoma di ogni essere umano è identico al 99,9%. Quindi solo una limitatissima percentuale di geni può variare da persona a persona.Abbiamo visto che ogni persona è portatrice di due alleli per ogni gene. Quando gli alleli sono uguali, si dice che quella persona, per quel gene, è omozigota. Se i due alleli sono diversi si dice che quella persona, per quel gene, è eterozigota. Negli eterozigoti, come abbiamo già riferito, uno dei due alleli è spesso dominante ed è espresso, l'altro è recessivo e può restare inattivo.

La presenza di due versioni per lo stesso gene risulta essere un naturale meccanismo protettivo, nel senso che, quando un allele risulta essere difettoso, può subentrare l'altro, che è in grado di compensare.

Per avere un'idea di come funzionino vediamo quello che succede per i gruppi sanguigni: ogni essere umano è classificato come gruppo A, B, AB oppure O. Questo perché il gene ABO ha tre alleli che sono A, B e O. Questi tre alleli hanno la struttura del DNA quasi identica perché, infatti, differiscono solo per pochissimi nucleotidi. Gli alleli A e B, che codificano rispettivamente per le proteine A e B, sono codominanti. Coloro che hanno gli alleli AA o AO, e quindi solo la proteina A, appartengono al gruppo sanguigno A. Coloro che hanno gli alleli BB o BO, e quindi solo la proteina B, appartengono al gruppo sanguigno B. Coloro che hanno ambedue gli alleli AB, appartengono al gruppo sanguigno AB. Coloro che sono 00, e quindi non hanno nessuna delle due proteine, appartengono al gruppo sanguigno O.

Come abbiamo già riferito le variazioni della struttura genomica fra un essere umano ed un altro sono limitatissime e riguardano praticamente singoli nucleotidi, nel senso che in una stessa posizione una persona può avere una G invece che una C, mentre un' altra può mancare di una T. Queste variazioni, meglio note come mutazioni e polimorfismi possono essere di vario genere e sono contraddistinte dalle denominazioni seguenti:

Sostituzione: una base invece di un’ altra.

Delezione: perdita di una base.

Inserzione: aggiunta di una base.

Inversione: una breve sequenza di basi è sostituita da un'altra che ha la stessa sequenza ma con direzione invertita.

Traslocazione: una breve sequenza di basi risulta rimossa e trasferita in un settore diverso.

I termini " mutazione " e " polimorfismo " sono spesso usati in modo intercambiabile, ma è più corretto considerare il polimorfismo una variazione di sequenza che si riscontra in almeno 1 % della popolazione e che, in genere, non produce effetti apprezzabili, mentre la mutazione è una variazione di sequenza più rara, ma che può essere dannosa.

EREDITÁ

Nel 1865 un monaco austriaco, Gregor Mendel, pubblicò il risultato delle sue osservazioni sulle modalità di trasmissione di tre caratteri dei piselli, ossia il colore dei semi, l’aspetto della superfice, liscia o rugosa, e l’altezza delle piante. Egli dimostrò come un certo “fattore” venisse trasmesso immodificato e con uguale frequenza da ciascuna generazione di piante alla seguente.

Le osservazioni di Mendel non furono prese in seria considerazione fino al 1902, quando Sir Archibald Garrod non dimostrò che l’alcaptonuria, una malattia umana, si trasmettesse in via ereditaria.

Sono dovuti trascorrere altri 90 anni dopo la prima osservazione di Mendel per capire che il fattore genetico individuato fosse il gene e come i caratteri ereditari si trasmettano fondamentalmente in base alle leggi di Mendel con il DNA, utilizzando un codice molto semplice, perché costituito da un alfabeto di 4 lettere, giustamene definito l’alfabeto della vita: adenina,citosina,guanina e timina. Tali quattro lettere poi si alternano in gruppi di tre creando 64 triplette o combinazioni, da cui derivano come vedremo, i 20 aminoacidi, che sono la base costituente di tutte le proteine, che sono a loro volta le più importanti molecole strutturali di tutti gli esseri viventi.

Appare sorprendente il fatto che tutti gli esseri viventi sia vegetali che animali si formino utilizzando lo stesso alfabeto e che sia possibile trasmettere geni anche da una specie ad un'altra ossia attuare il trasferimento genico che sta rivoluzionando tutta la biologia ed ha dato il via a non pochi dilemmi etici, perché la gente teme che gli organismi geneticamente modificati, possano, con il passar del tempo riservare delle sorprese.

Ogni uomo è formato da circa 100 miliardi di cellule e ciascuno di noi eredita un certo tipo di genoma, in cui sono presenti alcune variazioni che sono appunto dette ereditarie per distinguerle da quelle acquisite che possono comparire nel corso della vita per effetto di fattori tossici ambientali. Le mutazioni presenti nelle cellule somatiche spesso dovuti alle interazioni con l’ambiente, vengono trasmesse solo alle identiche cellule figlie mentre quelle presenti nelle cellule della riproduzione o germinali sono ovviamente trasmesse anche alle generazioni seguenti.

Tutti gli organismi eucariotici, che includono i funghi, le piante, i roditori e i primati, compreso l'uomo hanno cellule somatiche diploidi, che significa che in ogni cellula hanno due copie dello stesso gene in una coppia di cromosomi analoghi, che sono quindi in totale 46 che, come sappiamo, 23 sono di origine paterna e 23 di origine materna. Le cellule germinali, conosciute anche come gameti, sono dette invece aploidi perché hanno una sola copia di ogni cromosoma, in totale 23, e quindi una sola copia di ogni singolo gene.

Durante la fertilizzazione, si ha l'incontro e la fusione della cellula germinale uovo con la cellula germinale spermatozoo, ciascuna portatrice di 23 cromosomi e si riforma la cellula somatica in cui si ritrovano, per ogni gene, la copia di origine maschile e quella di origine femminile. Quindi per ogni gene si può avere l'incontro di alleli omozigoti o di alleli eterozigoti, a secondo se le due copie sono, per quanto riguarda la sequenza dei nucleotidi, identiche o diverse. Ma non tutti i caratteri del fenotipo, come vedremo, sono trasmessi ai discendenti secondo le leggi di Mendel. Per cui c’è sempre una certa differenza tra il genotipo ed il fenotipo, sia perché i meccanismi di trasmissione ereditaria sono molto più complessi ma anche perché su tale espressione interferiscono tutti i componenti ambientali.

Tutte le alterazioni o mutazioni del codice genetico possono essere neutre, ovvero senza apparente effetto, oppure benefiche o deleterie. Naturalmente, in questo ultimo caso, portano ad alterazione di funzioni e quindi possono anche determinare una malattia.

Un individuo che per una certa malattia è eterozigote, può non manifestare i caratteri o i sintomi di quella forma morbosa ma, essendo portatore, essere sempre in grado di trasmettere quella variante o allele alla prole. Quando però, il carattere riferentesi a quella malattia è dominante sull'altro allele recessivo, allora, anche nell' eterozigote può evidenziarsi la sintomatologia della malattia.

Molte variazioni del genoma, qualora determinino scambi di aminoacidi fondamentalmente simili, non producono effetti apprezzabili a livello cellulare o producono anche effetti benefici. Su ciò si basa non solo la grande diversità biologica ma anche ci fa capire come mai l'evoluzione, condizionata dalle interferenze con l’ambiente, abbia portato quasi sempre a far prevalere il meglio.

Altre mutazioni possono essere dannose nel senso che possono essere causa diretta di malattia o aumentare la suscettibilità ad una data malattia che può condurre anche a morte. Per esempio una mutazione del gene p53, che codifica una proteina capace di bloccare la proliferazione cellulare, può anche determinare un'abnorme crescita cellulare fino alla formazione di tumori. Non c'è quindi da meravigliarsi se in soggetti in cui sia presente tale mutazione compaiano poi lesioni cancerose.

La maggior parte delle mutazioni che si ritrovano nel genoma umano derivanti dalla relativa instabilità del DNA,riguardano singoli nucleotidi e prendono il nome di polimorfismi in singoli nucleotidi (SNP s ). Di tali sequenze mutate, nei cromosomi umani se ne trova all'incirca 1 ogni 1000.

Comunque, come vedremo, ci sono malattie genetiche ben definite dovute alla mutazione anche di un solo gene, mentre la maggior parte delle malattie, per non dire tutte, hanno una base genetica che determina la suscettibilità individuale, ma sono multifattoriali perché sono espressione delle interazioni di più geni e dei singoli geni con l’ambientee.

Comunque lo studio sempre più approfondito del genoma ci sta chiarendo i rapporti fra struttura e funzioni dei geni. Il Progetto Genoma Umano ha definito le sequenze nucleotidiche di tutti i vari geni e, quindi di tutti i cromosomi. Alla fine di questa memorabile impresa Prancis S. Collins ha giustamente esclamato: “Siamo alla fine dell'inizio”.

Ora, infatti, dobbiamo capire il funzionamento di tutti questi geni. Le domande che attendono una risposta sono molte. Ne ricordiamo alcune:

Quali geni sono espressi nei vari tessuti?

Come l'espressione di un gene può essere influenzato da influenze extracellulari ?

Quali geni sono espressi durante lo sviluppo di un organismo?

Come cambia l'espressione di un gene in fase di sviluppo e di differenziazione ?

Quale effetto deriva dalla disregolamentazione di un gene ?

Quale tipo di espressione genica può essere causa di malattia o favorire l'aggravarsi di una malattia. ?

Quale tipo di espressione genica può influenzare la risposta ad un certo tipo di trattamento ?

Il diffondersi delle analisi eseguibili con i microarray permetterà di chiarire questi ed altri numerosissimi quesiti riguardanti tutta la biologia sia del mondo animale che vegetale.

PROTEOMA

Il termine proteoma è stato coniato circa dieci anni fa per introdurre un concetto simile a quello del genoma, ma a livello delle proteine. Per qualsiasi essere vivente, lo si può definire come l'insieme delle proteine che sono codificate dal suo genoma.

Il concetto di proteoma è molto più complesso del suo predecessore genoma per le seguenti ragioni:

I geni sono formati dalle 4 basi A T C G , mentre le proteine sono composte da 20 aminoacidi.
I geni sono entità fisse lineari e stabili mentre le proteine sono molto diverse costituiscono delle entità dinamiche, che assumono conformazioni che, in alcuni casi, sfuggono a ogni previsione.
Ciascun gene dovrebbe codificare una sola proteina. Ma questa regola è parzialmente valida soltanto per la struttura primaria della proteina. In realtà si è visto che per una serie di ragioni, ciascun gene codifica da 3 a 20 proteine. Si tratta di proteine simili, ma basta la sostituzione di qualche aminoacido con un altro per modificarne le funzioni. Ma più spesso succede che talune proteine, pur avendo la stessa struttura primaria, si combinino con molecole di zuccheri, che sono idrosolubili, o con molecole di acidi grassi, che sono idrofobe e questo fa si che questo cambi radicalmente la struttura terziaria. Infatti una molecola proteica che sia nel sangue o nel citoplasma cellulare ricco di acqua, tende a portare la parte della molecola idrofila verso l'esterno. Si superficializzano epitopi diversi, cambia la funzione e si modifica il rapporto con le molecole circostanti.
Da quanto su riferito ne deriva che il genoma umano è composto da circa 30.000 geni mentre il proteoma arriva a circa 1.000.000 di molecole proteiche sostanzialmente diverse.

Ne consegue che l'identificare la sequenza degli aminoacidi che compongono una proteina può essere di scarsa importanza se si desidera sapere, non solo come effettivamente la molecola è strutturata, ma anche come funziona sia in condizioni fisiologiche che patologiche.

C'è poi un altro aspetto, non di secondaria importanza, che riguarda le relazioni di ciascuna proteina con l'ambiente circostante per cui si può avere che la stessa proteina in cellule diverse ha un comportamento diverso e può assolvere a funzioni diverse. Poi occorre tener presente che le interazioni fra proteine sono eventi transitori e la cinetica, secondo le circostanze, può cambiare molto. Ogni condizione del nostro organismo, a seconda di quanto siamo malati o di quali farmaci prendiamo, determina radicali cambiamenti del proteoma.

Ma se pure il proteoma è molto più complicato da studiare di quanto lo sia stato il genoma, moltissime aziende biotech stanno cercando di capire quali siano gli strumenti e le tecniche più adatti, non solo perché la proteomica è alla base della biologia ma perché si è convinti che tale approfondimento può aiutare molto lo sviluppo di nuovi farmaci.

Finora per capire quali siano le proteine presenti in determinate cellule o tessuti si sono utilizzate prevalentemente l' elettroforesi bidimensionale su gel, la spettrometria di massa e la cristallografia a raggi X.

Nell'elettroforesi bidimensionale si depone un piccolo campione della miscela di proteine sul bordo di un sottile strato di gel in grado di separare le proteine spostandole in due direzioni perpendicolari in base alla loro massa e alla loro carica elettrochimica. Pertanto ognuna diventa identificabile come una macchia distinta sul gel e quindi può essere prelevata e studiata con altre tecniche.

La spettrometria di massa utilizza magneti o campi elettrici per separare proteine differenti in base alla massa degli atomi che le costituiscono e i risultati appaiono come picchi di un grafico. Ma gli spettrometri di massa sono apparecchi molto costosi e non sempre si dimostrano utili nell'individuare le nuove proteine.

La cristallografia a raggi X consente di analizzare proteine preventivamente purificate e cristallizzate. Esaminando in che modo i raggi X vengano deviati dai singoli atomi di una proteina, si può capire come sia fatta la molecola ed intravedere la conformazione tridimensionale, che, come abbiamo già spiegato, per le proteine è importantissima.

Ma, con questi apparecchi, si riescono a catalogare le proteine presenti in un campione biologico ma non è questo l'unico obiettivo che si pongono gli studiosi del proteoma.

Per capire che cosa realmente facciano le proteine nel corpo e per sviluppare farmaci efficaci, dobbiamo sapere come varia la componente proteica da una cellula all'altra e, all'interno della cellula, con il mutare delle condizioni circostanti. Dobbiamo inoltre capire come le diverse proteine collaborino per portare a termine le varie attività della cellula.

Le proteine si combinano a formare reti funzionali e quindi è importante riuscire a capire con quali altre proteine una proteina, momento per momento, interagisca.

Servono quindi metodi nuovi e apparecchi nuovi. Siamo quindi certi che i microarray potranno dare un contributo fondamentale per la soluzione di tali problemi proprio perché adatti allo studio sistematico delle interazioni biologiche.

LE RETI DINAMICHE

Gli organismi viventi però non vivono nel vuoto ma, e tantomeno, in un ambiente statico, ma permanentemente coinvolti in continue e subentranti sfide ambientali che vanno da quelle dell’ambiente intracellulare a quelle dei singoli organi e sistemi interni all’ambiente esterno in cui ogni essere vivete compie giorno per giorno il suo ciclo di vita. Quindi, certamente, con la pubblicazione delle sequenze del genoma dei singoli esseri viventi fino quelli umani si sono create le basi di un sistema dinamico di vincoli che permettono alle cellule di agire in un certo modo. Ora ci si deve muovere verso una nuova frontiera e stabilira non solo le funzioni dei singoli geni ma anche scoprire i rapporti evolutivi e la logica che governa l’assemblaggio delle proteine coinvolte in complicate reti metaboliche che danno la possibilità a tutti gli esseri viventi di reagire in modo diverso a tutte le sollecitazioni sia dell’ambiente interno che esterno a cui si devono adattare.

L’elaborazione dell’informazione ereditaria rende possibile la costruzione di reti dinamiche d’interazione che caratterizzano le funzioni di tutti gli esseri viventi sia in condizioni fisiologiche che patologiche.

Ora, mentre conoscendo i genomi dei microrganismi è relativamente facile stabilire le funzioni dei singoli geni, lo stesso non si può dire quando si ha a che fare con genomi più complessi.

E’ ormai noto, infatti, che non tutta l’informazione biologica è racchiusa nelle sequenze del DNA che codificano le proteine, né che la funzione delle singole proteine derivi solo dalle sequenze degli aminoacidi che le compongono. Esistono certamente delle dinamiche interazionali che si esprimono a vari livelli delle attività cellulari e che, probabilmente, sono ancora sconosciute.

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CAPITOLO TRE

PREMESSE OPERATIVE

COSA SONO I MICROARRAY

Un microarray è una linea ordinata di elementi microscopici su una superficie piana su cui è possibile immobilizzare sia acidi nucleici che proteine capaci di riconoscere e legarsi con molecole complementari. Permettono di eseguire, pertanto, sia reazioni di ibridazione, quando si tratti di acidi nucleici, o reazioni immunitarie, quando si tratti di antigeni o anticorpi. Ci si possono legare anche cellule vitali per realizzare ricerche di vario genere.

Microarray è una nuova parola scientifica composta da " micro ", che in greco significa " piccolo " e dal francese " arayer ", che significa " sistemare ".

I microarray, che qualcuno ha anche chiamato biochips o gene chips, contengono un insieme di piccoli elementi, detti anche spots, sistemati su file orizzontali e colonne verticali.

Un microarray può essere considerato un mezzo diagnostico se presenta quattro caratteristiche standard ossia essere ordinato, microscopico, planare e specifico.

Ordinato

Significa che gli elementi analitici, detti anche molecole probe o chip o spot, devono essere disposti in modo ordinato e preciso lungo file orizzontali diritte ed incolonnati anche su file verticali perfettamente perpendicolari. I vari elementi devono essere, ovviamente, di grandezza uniforme e separati da spazi uniformi.

E' assolutamente necessario che tali elementi siano disposti in maniera ordinata, sia su linnee orizzontali che verticali, perché questo ne facilita la produzione in automazione e, quindi a costi contenuti, ma, ancora più importante, ne facilita e accelera l'esame e l'interpretazione dei risultati.

Ogni elemento deve essere uniforme per non rendere ambigua la lettura. Non è ammissibile la se pur minima sbavatura che rischierebbe di contaminare la lettura dell'elemento vicino. Elementi di forma diversa o di diversa densità, anche se contenenti lo stesso numero di molecole, darebbero luogo ad un segnale di diversa intensità, compromettendo la precisione del risultato.

Inoltre, ovviamente ogni elemento deve avere una collocazione ben precisa, in base alle sequenze desiderate, di modo che, automaticamente, si sappia che il dato che la macchina legge corrisponda ad un unico e ben preciso probe o spot.

Microscopico

Microscopico è qualsiasi oggetto le cui dimensioni siano inferiori ad 1 mm ( 1000 micron ). I probes dei microarray possono avere dimensioni variabili e comunque compresi fra i 15 e 350 micron, ma quelli realizzati con estratti di tessuti possono arrivare anche a 600 micron. Sappiamo infatti che i vari elementi analitici o probe possono essere prodotti con materiali diversi: infatti possono essere geni interi, porzioni di geni, e quindi DNA, cDNA, mRNA, proteine, anticorpi ed anche porzioni di molecole e addirittura frammenti di tessuti cellulari. I materiali utilizzati includono molecole naturali ottenuti dalle fonti più diverse o anche materiali sintetici. Comunque per avere un'idea più completa si sappia che il tipico spot o probe di DNA contiene circa 1 miliardo di molecole.

Si tende tuttavia a realizzare probe quanto più piccoli, e questo sia perché così se ne possono concentrare anche fino a oltre 5000 per centimetro quadrato. sia perché quanto più piccolo è il probe o spot tanto più veloce è la cinetica della reazione realizzabile.

Per rendersi conto dell' enorme importanza della miniaturizzazione degli elementi, basti pensare che sono stati già realizzati microarray che comprendono l'intero genoma umano e, quindi con circa 35.000 spots.

Planare

il substrato di supporto dei probes può essere di vetro, plastica o silicio ma è importante che sia perfettamente piano. il materiale finora più usato è stato il vetro sia perché è più facile realizzare superfici senza imperfezioni sia perché ci si lavora meglio.

il materiale di supporto deve essere solido, rigido, planare ed impermeabile e perché solo se ha queste caratteristiche è possibile realizzare una produzione di alta qualità in automazione e rendere possibile anche la lettura dei risultati in automazione.

Comunque, anche se il vetro è stato preferito, sono allo studio anche altri materiali che forse potranno essere utilizzati per specifiche applicazioni.

Specifico

Ogni microarray ha la funzione di misurare in modo preciso il numero, la quantità o la concentrazione di molecole presenti nel campione. Quindi è fondamentale che le molecole presenti nel campione o target vengano legate dal probe in modo assolutamente specifico ed il segnale che ne deriva deve essere esattamente correlato alla quantità.

Ogni target deve legare solo una specie delle molecole presenti nel campione ed esprimere la più accurata misura del gene o del prodotto genico; inoltre il risultato deve essere riproducibile con un alto livello di confidenza.

L'assoluta specificità di legame fra il probe o spot che è sul vetrino ed un solo tipo di molecola fra quelle presenti nel campione o target è il criterio fondamentale per poter utilizzare un determinato microarray per fare analisi.

DAL GENOMA AL PROTEOMA

I microarrays per il DNA hanno reso possibile la convergenza di due aree scientifiche molto diverse: la genetica e l'elettronica. L'origine di tale nuova tecnologia va fatta risalire agli esperimenti di Southern che, nel 1975, dimostrò come fosse possibile fissare il DNA ad un supporto solido ed attrarre, in modo specifico, una catena complementare sempre di DNA. Tale processo, poi largamente utilizzato per scopi diagnostici, è noto come “Southern blotting ".

Fu poi Fodor, che nel 1991, fabbricò i primi microarray, combinando il metodo fotolitografico, usato per i semiconduttori, per realizzarne i primi fissando degli oligonucleotidi su superfici di vetro. Avendo intuito l'importanza commerciale che tale tecnologia avrebbe potuto avere, fondò l'Affymetrix che ha avuto il merito di mettere sul mercato i GeneChip, che sono stati i primi vetrini con DNA utilizzabili per tests genetici.

Negli anni che sono seguiti i microarray con DNA hanno trovato una sempre più vasta applicazione in vari settori e con diversi fini. La tecnologia si è andata progressivamente affinando fino a produrre vetrini con decine di migliaia di microspots su pochi centimetri quadrati adatti per indagini molto complesse sulle modalità d'azione dei vari geni che prima non sarebbe stato possibile realizzare o avrebbero richiesto tempi molto lunghi.

Infatti solo con questa tecnologia è diventato possibile identificare, quantificare, e comparare in modo simultaneo l’espressione dei singoli geni. Quindi solo con questo approccio sarà possibile decifrare l’impianto regolativo delle reti geniche che controllano non solo i vari aspetti e funzioni del singolo fenotipo ma capire anche cosa effettivamente avviene in tante malattie la cui patologia rimane ancora in tutto o in parte oscura.

Oggi, che conosciamo la struttura dei singoli geni, dobbiamo capire se in un dato momento siano in funzione o meno, ma capire anche ed interpretare la dinamica delle migliaia di informazioni che ne derivano.

Infatti questo è il problema che interessa moltissimo non solo ai genetisti ma a tutti i medici, i biologi e tutti coloro che sono interessati a decifrare i più reconditi meccanismi e rapporti riguardanti tutti gli esseri viventi sia del mondo animale che vegetale. Ormai conosciamo esattamente la struttura dei geni di migliaia di piante e animali, uomo compreso, ma ora vogliamo capire come, quando e perché funzionano.

Abbiamo visto che, fino a qualche anno fa si credeva che ogni gene codificasse un solo tipo di m RNA e quindi, almeno teoricamente, una sola proteina ed attraverso di essa, impartisse istruzioni alle strutture cellulari e quindi al metabolismo. Oggi sappiamo invece che la realtà è molto più complessa perché ogni gene, con le varianti, può codificare fra 3 e 20 proteine. Quindi per capire come i geni funzionano bisogna arrivare alle proteine che essi esprimono e capire anche come le varie proteine interagiscono fra di loro. Ne deriva che se è stato molto importante studiare a fondo il genoma è ancora più importante studiare il proteoma, ossia lo sconfinato mondo delle proteine che è molto più complesso, anche perché non statico ma continuamente mutevole in un contesto di reti dinamiche per la continua serie di interazioni che avvengono fra diloro per effetto sia dei processi metabolici sia come risposta agli stimoli ambientali.

Infatti tutti gli acidi nucleici sono costituiti da quattro basi, sono sempre idrofilici e di carica negativa. Le proteine, invece, sono costituite da 20 aminoacidi, possono essere sia idrofiliche o idrofobiche, e sono alcune acide ed altre basiche. Ne consegue che, per poterci lavorare, si devono adoperare diversi tipi di soluzioni. Poi le proteine hanno una struttura terziaria con gruppi attivi che ne caratterizzano le funzioni individuali e, quindi, mentre il DNA è molto stabile, alcune proteine sono in genere molto delicate per cui possono essere denaturate da sbalzi di temperatura o umidità dell' ambiente. Solo gli anticorpi, che per fortuna sono largamente usati per la produzione dei microarray come molecole di cattura, sono molecole proteiche piuttosto robuste.

Queste maggiori difficoltà hanno reso piuttosto difficile il trasferimento delle tecnologie usate per produrre i microarray con DNA alla produzione dei microarray con spots di proteine.

C'è poi un altro aspetto che ha reso più difficile ancora tale trasferimento: mentre i geni umani, che sono il caso limite, sono circa 30.000, si ritiene, che nel corpo umano, dato che si possono trovare numerose varianti delle singole proteine, il numero complessivo di strutture proteiche diverse del proteoma possa arrivare a circa un milione.

Comunque l'interesse per allestire microarray per le proteine è enorme sia perché le varie attività cellulari sono prevalentemente realizzate attraverso interreazioni fra proteine sia perché la maggior parte dei farmaci esercitano i loro effetti reagendo con le proteine.

I primi esperimenti ben riusciti con le proteine sono quelli di Silzel ( 1998 ) che allestì, su un film di polistirene, degli spots di 200 micron con anticorpi monoclonali e dimostrò che le reazioni con le proteine del mieloma erano dose dipendenti.

PROPRIETA' DELLE SUPERFICI

La qualità delle superfici ha un' importanza enorme nella produzione di microarray che possano essere usati per eseguire delle analisi ed ottenere risultati riproducibili. Infatti le superfici dei vetrini che si adoperano giocano un ruolo importantissimo nel determinare non solo come le molecole probe ci si attaccano ma anche per far si che le reazioni che ci si svolgono, possano evolvere senza problemi o inconvenienti.

Riteniamo pertanto utile elencare le qualità essenziali che microarray ideali dovrebbero avere per poter operare bene:

Dimensione

L'ampiezza delle superfici operative dipendono ovviamente dalle dimensioni del supporto. Come già abbiamo accennato, attualmente si preferisce operare su vetrini portaoggetto le cui dimensioni ottimali sono in larghezza, lunghezza e spessore 25-76-0,94 mm.

Tale dimensione standard facilita sia l'automazione della produzione che tutte le fasi operative di utilizzazione che si concludono con la lettura dei risultati.

Liscia

La superficie di lettura deve essere omogenea e liscia. Non sono accettabili irregolarità in eccesso o in difetto superiori ai 10 micron. Infatti se la superficie non è omogenea il diametro e la fissazione dei probes o spots non può risultare uniforme né si riesce ad ottener una regolarità delle distanze fra un probe e quelli vicini. Irregolarità della superficie possono creare problemi anche in fase di lettura perché alcuni lettori hanno una profondità focale che non supera i 20-30 micron

Planare

Tutta la superficie di 25-76 mm deve essere assolutamente in piano. Dislivelli superiori a 10 micron, per le stesse ragioni riferite in precedenza compromettono sia la produzione che la corretta utilizzazione dei microarray. A riguardo bisogna anche curare il confezionamento degli stessi facendo in modo che vengano evitate manovre che possano determinare alterazioni da torsione.

Occorre rendersi conto che lo stesso numero di molecole se disposte su un vetrino che non sia perfettamente in piano o non sia liscio producono un segnale di intensità variabile.

Uniforme

L'uniformità dipende dalla regolarità sia atomica che molecolare del trattamento utilizzato per rendere la superficie reattiva. Una superficie si può considerare uniforme se le eventuali variazioni di densità dello strato reattivo non risultino superiori o inferiori del 25%

Lo strato. reattivo è costituito da un monostrato, di solito di organosilani, che sono molecole che stabiliscono un legame covalente con il supporto che, in genere è vetro. Su questo strato poi va creato un film di acrilamide, polilisina, o nitrocellulosa che sono molecole capaci di legare i singoli elementi analitici.

Nel complesso, quindi, l'uniformità della superficie è molto importante per poter avere microarray affidabili perché capaci di generare segnali che non varino d'intensità per ragioni che nulla hanno a che fare con la specificità della reazione.

Stabile

La produzione va curata in modo da ottenere prodotti che, nel periodo di validità che, secondo i tipi può essere variabile, decadano meno del 10%. Devono essere prodotti molto stabili, considerando anche che le tecniche di utilizzazione possono essere diversissime e che alcune utilizzano anche temperature elevate.

Inerte

Premesso che il tipo di vetro che si sceglie deve essere perfettamente trasparente, anche i trattamenti a cui lo si sottopone per poterci fissare poi sopra le molecole dello spot, non devono compromettere tale trasparenza più di un certo livello standard. Inoltre il tutto non deve presentare fluorescenza anomala né avere effetto deviante sulla luce.

Efficiente

La capacità di legame, che va misurata empiricamente da caso a caso, deve essere tale da rendere possibile la più bassa concentrazione possibile dei reagenti sia perché sono, di solito, molto cari sia perché cosi si ottiene la massima efficienza. Per esempio vediamo che, quando si adoperano oligonucleotidi quali molecole spot, la concentrazione ottimale è di 30 µM, e da tale concentrazione non è consigliabile derogare, in eccesso o in difetto, più del 30%.

CHIMICA DELLE SUPERFICI

I primi tentativi di fissare biomolecole su membrane di nylon o cellulosa, eseguiti nel trascorso decennio, puntando all' adsorbimento elettrostatico, hanno portato a risultati molto scadenti. Lo stesso è successo utilizzando superfici a base di poliacrilamide.

I primi risultati accettabili si sono avuti ricoprendo le superfici con del destrano carbossilmodificato.

I trattamenti chimici delle superfici attualmente più usati per gli acidi nucleici sono a base di:

Organosilani: sono composti che contengono atomi di silicio che si sono dimostrati molto validi per legare molecole organiche a superfici di vetro.

Esteri del silicio: sono una sottofamiglia dei precedenti caratterizzati dalla presenza di un atomo di ossigeno fra il silicio ed il carbonio. Uno dei più rappresentativi è il trietilmetoxil silano.

Amine primarie: nel gruppo amminico un atomo di azoto è legato direttamente ad un gruppo organico.

Amine alifatiche: il gruppo amminico è legato ad una catena di idrocarboni. n legame che si crea con le biomolecole, in questo caso, è di tipo elettrostatico e quindi si realizza un semplice assorbimento.

Aldeidi: permettono di realizzare un legame covalente, e quindi più stabile, ma disturbano la fluorescenza con un discreto rumore di fondo ovviamente aspecifico.

Le molecole utilizzate per fissare alle superfici gli acidi nucleici sono state utilizzate con discreto successo anche per le proteine. Ma oltre a queste, per poter realizzare un migliore e più regolare orientamento delle biomolecole da legare, che per le proteine è molto importante, sono stati utilizzati anche altri trattamenti di cui ricordiamo i seguenti:

Metalli come il nichel, adoperato per studiare il proteoma dei lieviti, ma che si dissociano facilmente, specialmente se si adoperano soluzioni che contengono EDTA.

Streptavidina: permette di creare il legame biotina-avidina, che è uno dei legami più stabili fra quelli non covalenti.

Ancora migliori si sono dimostrati i trattamenti delle superfici che creano anche un effetto da profondità che genera un legame migliore perché tridimensionale. Ricordiamo i seguenti:

Nitrocellulosa che praticamente è un polimero a base di glucosio nitrato.

Agarosio che funziona abbastanza bene ed è di facile preparazione.

Polimeri di vario genere.

DEFINIZIONI DA CHIARIRE

La pubblicazione che descrive le prime analisi eseguite con i microarray (Schena et al. 1995 ), usa il termine " target" per descrivere il DNA ( prodotto con la PCR ) attaccato al substrato, e il termine " probe " per descrivere il campione mRNA stratificato poi sopra ed in grado di interagire. Nella letteratura che è seguita, non tutta la comunità scientifica ha utilizzato gli stessi termini, anzi li ha invertiti, per cui ne è derivata una certa confusione. Molti, per esempio preferiscono il termine spot per indicare la molecola di cattura. Noi ci adegueremo alla tendenza attualmente più diffusa che è quella di chiamare probe o spot la molecola di cattura fissata al substrato che riveste la superficie del vetrino e target la molecola da catturare presente nel campione.

MICROARRAY CON ACIDI NUCLEICI

Gli acidi nucleici sono il tipo di probe più comune adoperato finora, ma, come riportiamo in seguito, molte altre molecole o materiali anche complessi, possono essere fissati sui vetrini per produrre microarray quali enzimi, anticorpi. carboidrati, lipidi. virus, batteri, cellule vegetali, cellule animali, estratti proteici, composti inorganici ecc. Spesso ci si legano materiali già preparati ma, in alcuni casi si preferisce realizzare delle molecole con sintesi attuate in loco. Praticamente ogni tipo di molecola, se già preparata, può essere usata come probe o microspot mentre, talora, si preferisce eseguire delle sintesi in loco solo per gli oligonucleotidi e per. taluni peptidi.

Prodotti da PCR ( Polymerase Chain Reaction ).

I primi esperimenti di analisi eseguite con i microarray sono stati realizzati usando probe preparati con la PCR noti come cDNAmicroarrays e long-oligoarrays quando si tratta di oligo di una certa lunghezza.. Mediante tale processo di sintesi automatizzata si possono produrre microgrammi di qualsiasi segmento di DNA che interessi e di qualsiasi tipo di organismo, inclusi batteri, funghi, piante e animali.Tali prodotti ottenuti con la PCR vanno poi purificati per allontanare i primers e gli enzimi che influirebbero negativamente sulle ibridazioni causando interferenza.

I prodotti da PCR sono generati utilizzando sia primers comuni sia primers specifici per determinati geni. Nella produzione dei microarray si utilizzano tutti e due i tipi.

Con una coppia di primers comuni è possibile amplificare migliaia di elementi target utilizzabili per la produzione di microarray. Infatti una coppia di primers comuni permette di amplificare diversi tipi di sequenze con lo stesso grado di efficienza, perché i primers sono ottimizzati per legarsi ad alta efficienza alle sequenze del vettore che è costituito da un plasmide o qualsiasi molecola trasportatrice di un inserto di DNA. All'uso di primers comuni consegue un piccolo inconveniente perché porta alla realizzazione di probe che sono contaminati da piccole quantità di sequenze del vettore. E' importante quindi la selezione dei primers, scegliendo quelli che interferiscano meno.

I primers gene specifici sono utilizzati per ottenere un unico elemento probe. Sono quindi preferibili perché non inseriscono sequenze contaminanti, ma tutta l'operazione costa molto di più. Per averne un' idea basti pensare che per amplificare i 6000 geni del Saccaromyces cerevisiae ne occorrono 12000.

I prodotti da PCR hanno il vantaggio di essere di dimensioni relativamente grandi ( 500-5000 paia di basi) e quindi forniscono un materiale ampiamente complementare per la successiva ibridazione, generando un materiale in grado di emettere un apprezzabile segnale fluorescente praticamente in ogni tipo di esperimento. Quindi questa tecnologia è largamente utilizzata in ogni tipo di laboratorio convenzionale anche perché il costo del materiale che se ne ottiene è di gran lunga inferiore rispetto a quello che deriva da sintesi di oligonucleotidi.

Lo svantaggio dei prodotti da PCR è dato dal fatto che sono a doppia elica e quindi per poter essere utilizzati in reazioni di ibridazione sui microarray devono esser prima denaturati mediante ebollizione per qualche minuto. Ne deriva il fatto che, siccome le due catene tendono a fondersi di nuovo, si realizza sempre un materiale contaminato da molecole che non possono ibridizzare e questo disturba l'espletamento della reazione, riducendo il segnale.

Un secondo inconveniente è dato dal fatto che danno luogo a spots di dimensioni notevoli e quindi possono generare l'inconveniente di causare ibridazioni crociate quando si studino geni che abbiano considerevoli identità di sequenze ( oltre il 70% pari a migliaia di nucleotidi ).

Oligonucleotidi

Gli oligonucleotidi sono corte catene singole di DNA o di RNA. e presentano dei vantaggi per la produzione dei microarray rispetto a quelli realizzati con DNA in quanto non richiedono né l’uso di batteri né l’amplificazione del clone.

Ne risulta che, essendo ridotti i problemi di contaminazione, non risulta essere necessario il controllo delle sequenze. Sono utilizzati largamente, come molecole di cattura, anche nella produzione dei microarray sia prodotti a parte, e poi legati sul supporto, sia sintetizzati direttamente in loco con la fosforamidite. La sintesi in loco è da taluni preferita per produrre probe con non più di 25 nucleotidi, mentre, se prodotti a parte, si può arrivare anche a 120 nucleotidi.

Per quanto riguarda il genoma umano oggi è possibile acquisire facilmente la serie completa delle sequenze del DNA ( www,nebi.nlm.nih.gov/ ) e quindi ci si può produrre, in maniera molto specifica, qualsiasi tipo di sequenza e questo ovviamente determina un indubbio vantaggio per la produzione di probe rispetto a quelli ottenibili utilizzando i prodotti da PCR. C'è lo svantaggio, con gli oligonucleotidi, che, almeno con certi tipi di campioni, si ha un segnale fluorescente più debole. E, comunque, quando, non sono note le sequenze, non conviene utilizzarli.

MICROARRAY CON PROTEINE

Le proteine sono considerate le più importanti strutture cellulari per il continuo ed intenso lavoro che svolgono sia in stato di benessere che in corso di malattia. A differenza del genoma che è costituito da un numero fisso di geni, il livello a cui le proteine cellulari operano è molto dinamico perché le proteine, direttamente sottoposte a tutti gli stimoli dell'ambiente vanno incontro a continue variazioni di adattamento e risposta. Ecco perché è molto difficile determinarne accuratamente l'esatto numero o le quantità presenti nelle cellule viventi. Inoltre le varie famiglie di proteine sono estremamente diverse fra loro sia per le dimensioni delle molecole, sia per la struttura, che per le caratteristiche chimiche e le funzioni.

Negli ultimi anni, la tecnologia dei microarray, messa a punto per studiare gli acidi nucleici, si è andata espandendo per analizzare meglio il proteoma delle cellule e le interreazioni che avvengono fra le diverse proteine e fra queste e l' ambiente esterno, che sono molto importanti nel determinismo delle malattie e le cui conoscenze certamente faciliteranno la messa a punto di nuovi farmaci.

Abbiamo già riferito che il primo tentativo ben riuscito di allestimento di microarray con proteine è stato realizzato utilizzando degli anticorpi. Ebbene riteniamo che l'uso dei microarray con anticorpi permetterà, nei prossimi anni di mettere a punto numerosi nuovi farmaci dato che, ormai, nel mondo sono allo studio alcune decine di anticorpi monoclonali umanizzati che potrebbero superare sia la sperimentazione di laboratorio che, almeno alcuni, le prove cliniche.

Poi il sequenziamento di tutto il genoma umano ha aumentato enormemente il numero di molecole che oggi sono considerate determinanti nella patogenesi di varie forme morbose. Siamo pertanto convinti che certamente, alcune di queste, diventeranno bersaglio di nuovi farmaci la cui individuazione e dosaggio sarà certamente agevolata studiando tali interreazioni con i microarray.

Comunque i microarray con proteine, oltre che in campo terapeutico, possono trovare sempre più ampia applicazione in campo diagnostico specialmente per le malattie infettive di origine virale. Infatti attualmente i metodi più largamente usati per individuare agenti patogeni virali in campioni biologici, sono quelli che si basano sull'immunoenzimatica eseguita in piastrine o su la PCR. Ma i primi hanno una sensibilità che oscilla fra il 70 e 90% ed i secondi hanno un costo elevato che ne limita la diffusione su larga scala specialmente in nazioni del terzo mondo che poi sarebbero quelle che ne avrebbero più necessità.

Si ritiene pertanto che, probabilmente, i microarray potranno assolvere meglio a tale funzione perché, dato i ridottissimi volumi necessari dei reattivi, alla fine dovranno costare meno. Le stesse considerazioni valgono per altri settori della diagnostica quali l'allergia, le malattie autoimmuni, i markers tumorali ecc.

Per la preparazione di microarray dedicati specificamente, le proteine da usare come probe, che qualcuno preferisce chiamare " protein chip " o semplicemente " chip ", possono essere derivate da estratti cellulari oppure sintetizzate mettendo insieme dei peptidi sintetici. Le proteine possono anche essere prodotte in colture di batteri, lieviti, cellule ingegnerizzate di insetti. Tali proteine ricombinanti, sono poi purificate con tecniche diverse e possono diventare un ottimo materiale da immobilizzare sui vetrini come molecole di cattura.

I metodi per fissare le proteine sui supporti sono fondamentalmente simili a quelli utilizzati per gli acidi nucleici. Come vedremo, però, produrre microarray con le proteine offre qualche difficoltà in più. Infatti, come primo inconveniente c'è il problema che le proteine sono molto meno stabili degli acidi nucleici perché vanno incontro spesso a processi di ossidazione e di denaturazione. Poi le proteine, quando sono rimosse dal loro ambiente naturale, modificano la loro struttura nativa e quindi anche la forma, talvolta esponendo all'esterno aminoacidi diversi da quelli della forma nativa. Ne deriva che, quando le si va a far reagire, questi aminoacidi esterni, che costituiscono gli epitopi più esposti, possono pregiudicare il risultato della reazione.

Comunque sono stati studiati diversi tipi di microarray per le proteine che Dev Kambhampati, nella sua interessantissima monografia (2004), suddivide così:

Array con anticorpi: Sono stati utilizzati sia anticorpi policlonali che monoclonali per titolare proteine specifiche in campioni biologici. Si possono considerare dei tests immunologici in miniatura.

Array con antigeni: E' l'inverso del precedente, perché in questo caso è fissato un antigene sul supporto per titolare il corrispondente anticorpo presente nel campione biologico.
Array funzionali: Proteine purificate sono fissate sul supporto per legare altre proteine o DNA o interagire con altre piccole molecole.
Array di cattura: Molecole non proteiche ma capaci di legarsi alle proteine sono ancorate alla fase solida. Esempio il Ciphergen Protein Chip.
Array in sospensione: E’ un caso particolare che utilizza come fase solida delle microparticelle fornite di qualcosa di simile ad un codice a barre.

MICROARRAY CON CELLULE

Le cellule sono le unità fondamentali dei tessuti di tutti gli organismi viventi sia da un punto di vista strutturale che funzionale. La cellula è una entità microscopica ma estremamente complessa che contiene una mescolanza eterogenea di sostanze essenziali per la vita.

Nella cellula troviamo una serie di strutture e di compartimenti, di cui il più importante, difatti è il più protetto, è il nucleo. Una membrana infatti avvolge il nucleo in modo che resti immerso ma separato dal citoplasma, che costituisce il resto e la parte più esterna della cellula e che, a sua volta è avvolto dalla membrana cellulare. Il nucleo contiene il lunghissimo filamento di DNA, su cui sono dislocati i geni, che nella cellula agiscono come il programma di un computer.

Ora, con l'aiuto dei microarray, è da poco iniziato lo studio riguardante le modalità di espressione dei geni nei diversi tessuti a cominciare, per l'uomo, dalle strutture del cervello, fegato, prostata, polmoni ecc. Si cerca di integrare quello che già riusciamo a sapere grazie all'istologia e la biochimica con la comprensione di come e quando i vari geni si attivino nei diversi organi e tessuti sia in condizioni di normale attività che nel corso di vari processi patologici.

E' merito della Cellomics Inc. di Pittsburgh di aver messo in commercio i primi microarray, The Cell Chip, allestiti anche con cellule viventi.

TAMPONI

Sono molto importanti per la preparazione dei probes sia per gli acidi nucleici che per le proteine perché devono rendere possibile un efficiente ancoraggio delle molecole di cattura o microspot stabili ed uniformi, senza nessuna sbavatura ed esaltare la visibilità dello spot. Inoltre, quando si tratta di proteine, ridurre le conseguenze dell'essiccamento ed evitare la denaturazione.

I tamponi hanno, quindi, una notevole importanza nel determinare l'efficienza di deposizione del probe sul supporto solido. Si deve formare un microscopico menisco omogeneo nella forma, a contorni netti e perfettamente aderente. Per aumentare l'efficienza di contatto si cerca di utilizzare miscele saline piuttosto viscose perché la viscosità aumenta le forze di contatto.

I tamponi hanno anche una grande influenza nel determinare l'intensità del segnale, che deve essere colorato, fluorescente o chemiluminescente, ma senza interferenze da parte dei cristalli della soluzione salina..

Nelle soluzioni acquose, il cui principale ingrediente è ovviamente l’acqua. le forze coesive di legame sono dovute all'idrogeno. I tamponi con molti legami idrogeno producono goccioline o spot più piccoli. Soluzioni contenenti basi, alcool o solventi hanno legami idrogeno più deboli e quindi portano alla formazione di goccioline o spot più larghi che possono più facilmente causare fusioni di spot da sbavature.

La forma e la grandezza dello spot sono anche determinate però dalle caratteristiche della superficie del supporto solido. Infatti superfici idrofobiche, che si realizzano in presenza per es. di aldeidi, producono spot più piccoli di quelli che si formano su superfici idrofiliche per la presenza di amine.

Un buon tampone deve anche accrescere la stabilità delle molecole del probe. Tale qualità è particolarmente importante per i microarray di proteine perché i relativi polipeptidi sono piuttosto instabili.

Pertanto i tamponi per la preparazione dei microarray di proteine talvolta contengono il glicerolo o altri additivi in grado di accrescere la stabilità del prodotto finale perché evitano la disidratazione totale.

Per la stessa funzione i tamponi per i microarray per gli acidi nucleici contengono DMSO (dimetilsulfossido ).

TARGET

I targets sono i campioni da fare interagire. Anche questi devono essere in qualche modo preparati. Per quanto riguarda gli acidi nucleici, spesso occorre fare in modo che il segnale venga amplificato. In tutti i casi, sia per gli acidi nucleici come per le proteine poi è necessario legarli ad una molecola rivelatrice che, per lo più, finora è stato un colore fluorescente.

Il legame con la molecola fluorescente può essere covalente e diretto oppure non covalente ed indiretto, quando si usano anticorpi, dendrimeri o altre molecole interposte.

Campioni con acidi nucleici

La preparazione dei campioni con acidi nucleici utilizza procedure diverse, che variano secondo i casi. Sono tutte abbastanza complesse per cui preferiamo tabularle cosi come sono riferite da Schena ( 2002 ).

Criteri	Trascrizione Inversa	RNA Polimerasi	Procedura Eberwine	TSA	Dendrimeri
Tipo indiretta	diretta	diret. o indiret	diretta indiretta
Template -DNA	RNA	DNA doppia elica e promotore	DNA doppia elica e promot	RNA o DNA con piccola molecola di legame	RNA o DNA in dendrimeri
Prodotto oligonucleotide	T3 o T7 nucleotide	T7 RNA polim nucleotide	nucleotide	nucleotide	nucleotide
Reattivo oligonucleotide fluorescente modificato	modificato	modificato o anticorpo coniugato TSA	modificato	modificato	modificato o dendrimero
Interazione	Ibridazione	Ibridazione o piccolo anticorpo	Ibridazione	piccolo anticorpo	Ibridazione
Amplificazione	nessuna		100-1.000.000	100	10-350
Tipo di amplific	nulla	nulla, enzim o passiva	passiva aumento quantità RNA	enzimatica	passiva
Colore fluorescente	Cianina	Cianina	qualsiasi	Cianina	Cianina
BIODIP	Alexa				Alexa
Processo	nulla	fino a 3 ore	nulla ma l'amplificazione del RNA diversi giorni	3 ore	3 ore

Riteniamo utile completare quanto riferito nella su esposta tabella con qualche altro dato che può risultare utile per interpretarla:

Trascrizione inversa

E' stato il metodo utilizzato nei primi esperimenti con i microarray. Da questo metodo base sono poi derivate numerose varianti. usando sia RNA cellulari, che sono molto più facili da ottenere, che mRNA. Sono state anche utilizzati diversi tipi di trascriptasi inverse e diversi metodi di purificazione dei campioni.

Il principale vantaggio di questo metodo è dato dalla coniugazione diretta che elimina i trattamenti da fare dopo l'ibridazione, che sono sempre ardui e richiedono molto tempo per essere espletati.

Lo svantaggio maggiore è data dal fatto che si ottiene un segnale molto meno evidente di quello che si ha con l'approccio indiretto che si giova dell' effetto dell' amplificazione.

RNA polimerasi

Questo, oltre alle trascriptasi inverse è un altro gruppo di enzimi largamente usati per preparare campioni per microarray. Si tratta di una famiglia di enzimi estratti da virus batterici ( T3 e T7 ), che catalizzano la sintesi del RNA partendo da un DNA a doppia elica, grazie all'azione di promotori specifici. Si tratta di un processo robusto e ad alta resa che da la possibilità di produrre quantità notevoli di RNA, che poi può essere diviso facilmente in piccoli frammenti a livello di oligonucleotidi con possibilità di amplificazione del segnale anche di 100 volte.

Bisogna solo stare molto attenti ad evitare l'azione delle ribonucleasi che attaccano facilmente le molecole di RNA. Si consiglia quindi di operare in stanze molto ben pulite, utilizzare guanti di gomma sintetica e, ovviamente, essere certi che reattivi e tamponi siano assolutamente privi di ribonucleasi.

Procedura Eberwine

Si tratta di un metodo molto ingegnoso che si basa sull'uso della RNA polimerasi da T7, che converte mRNA in cDNA con amplificazione, che per ogni procedura è di circa 100 volte e che, alla fine, può arrivare fino a 1.000.000 volte rispetto al materiale di partenza. Pertanto questo è il metodo preferito quando si devono risolvere particolari problemi biologici che non si possono risolvere con altri metodi.

Lo svantaggio di questo metodo è che è piuttosto arduo e lungo. Infatti occorrono 2-3 giorni per completarlo e poi si attua attraverso manipolazioni durante le quali non si riesce a seguire cosa stia succedendo, per cui, se ci sono interferenze da reagenti inattivi o da contaminazioni da ribonucleasi, lo si capisce solo alla fine, di fronte a risultati inattesi.

Amplificazione del segnale da tiramide ( TSA )

La tiramide, in questa procedura, ha la funzione di potenziare il segnale di varie sostanze fluorescenti, come la fluoresceina, la cianina 3 o la cianina 5, per cui si possono realizzare reazioni che portano alla formazione di colori diversi.

La trascriptasi inversa è usata per incorporare la biotina o il dinitrofenolo al cDNA, che poi viene ibridizzato su un microarray ed incubato con un anticorpo coniugato alla perossidasi. Il chip, così composto, è trattato con acqua ossigenata per cui la perossidasi ossida il segnale fluorescente della tiramide. Ne deriva un segnale fluorescente molto intenso, fino a 100 volte. E' un segnale, però, che ha un'emivita molto breve.

Dendrimeri

Il termine dendrimero deriva dalle parole greche “dendron” e “meros” che significano rispettivamente “albero” e “parte”. Infatti sono costituiti da ordinati grovigli di monomeri di oligonucleotidi che ricordano la chioma di alberi e che si formano, per processi di sintesi progressivi, anellandosi gli uni agli altri attraverso cicli progressivi che possono arrivare a formare anche molecole di DNA aventi un PM di 12000 e contenenti 36000 basi. Le singole molecole fluorescenti attaccate alle numerose estremità sporgenti o braccia del polimero determinano la comparsa di un segnale fluorescente molto intenso. Un polimero con 300 molecole di colore produce un segnale 300 volte più intenso. Ne deriva che polimeri aventi un diametro di 0,2 micron si vedono anche ad occhio nudo. Nel complesso è una tecnica che, anche se non facile da eseguire, presenta molti vantaggi.

Campioni con proteine

Le proteine, usate come targets, hanno una storia più recente e, quindi, si può dire, che si tratta di una tecnologia che è ancora agli albori, ma le prospettive sono enormi perché nella maggior parte delle malattie si verifica un'alterazione delle proteine e delle reazioni proteine-proteine. Inoltre la maggior parte dei farmaci interagisce con le proteine cellulari. Quindi sono le proteine, non i geni, i veri obiettivi della medicina.

Pertanto, da qualche anno, si è cominciato a preparare targets con proteine fluorescenti per approfondire fondamentali problemi di biochimica delle proteine.

Il reattivo fluorescente finora più utilizzato è stato l'isotiocianato di fluoresceina, che si lega molto facilmente agli aminoacidi lisina ed arginina, che sono presenti sulla superficie della maggior parte delle proteine estratte da animali, piante e microrganismi. La coniugazione di 50 microgrammi di isotiocianato ad 1 mg di proteina da luogo ad un segnale fluorescente sufficientemente evidente.

I reattivi del gruppo della cianina, anche, si legano facilmente alla lisina ed alla arginina e , quindi, per lo stesso scopo vengono utilizzati con successo.

Un altro reattivo fluorescente usato per le proteine è la ficoeritrina. Il procedimento, in questo caso, è più indaginoso perché tale prodotto va pretrattato con la succinimide ed anche la proteina, prima della coniugazione va attivata con il ditiotereitolo, per creare gruppi sulfidrilici.

AMBIENTI

Lavorare con i microarray è un'attività fine e sofisticata che non si può svolgere dovunque. Pertanto, specialmente per la produzione, occorrono ambienti ad aria pressurizzata e a contaminazione controllata. Sono preferiti i filtri laminari verticali a soffitto che sono più funzionali e non tolgono spazio laterale.

Tale tecnologia ha le sue radici sia nell'uso che se ne è fatto in microbiologia sia nell'industria dei semiconduttori, che ha le stesse esigenze per la lavorazione delle lamine di silicio, utilizzate per la produzione dei computer.

Infatti ci sono cinque forme di contaminazione ambientale: contaminazione da particelle, biologica, chimica, termica ed elettrostatica.

CONTAMINAZIONE

Contaminazione da particelle

Si considera essere particella ogni forma di detrito esistente nell'aria il cui rapporto fra lunghezza e larghezza non sia superiore di 10: 1. Le particelle più comuni derivano da polvere, forfora, garza, spore, pollini, funghi e batteri. Sono considerati invece fibre i detriti più lunghi. La contaminazione può avere origine dalle strutture dell' ambiente o dalle attrezzature che si adoperano ma spesso c'è una notevole componente che ha origine umana e specialmente dalle persone che ci lavorano dentro.

Per quanto riguarda l'ambiente bisogna considerare almeno tre condizioni o fasi diverse: ambienti in fase di avvio. ambienti operativi, ambienti in fase di riposo.

Ambienti in fase di avvio

Riguarda la fase seguente la costruzione e dopo che sono stati introdotti tutti gli apparecchi, possibilmente nuovi, perché contaminano meno, e solo le attrezzature necessarie alla lavorazione. Non ci deve essere altro. Dato il grande movimento che c'è stato, certamente sarà presente una contaminazione di livello molto elevato. Prima di poter utilizzare un ambiente del genere bisogna, dopo le opportune pulizie e disinfezioni, far trascorrere almeno una settimana di continuo funzionamento dei sistemi di filtrazione dell'aria e di decontaminazione per poter sperare che la concentrazione delle particelle abbia raggiunto un livello accettabile.

In base agli standard federali americani, gli ambienti a contaminazione controllata sono stati suddivisi in classi, in base al numero di particelle presenti di diametro maggiore di 0,5 micron. La classifica degli ambienti può essere fatta in base alla seguente tabella:

Tipo	Numero di particelle per piede cubico
Classe 1	1
Classe 10	l0
Classe 100	100
Classe 1.000	1.000
Classe 10.000	10.000
Classe 100.000	100.000
Laboratori di ricerca 20.000	200.000
Aria di città 5.000.000	500.000.000

Quindi, dato che le particelle di polvere possono creare una fluorescenza di fondo sui vetrini, o comunque delle immagini alterate oltre che, come abbiamo accennato, alterare la composizione dello spot, per la presenza di enzimi, è vivamente raccomandato che gli ambiente in cui si trattano i vetrini con i substrati o si distribuiscono gli spots siano di classe 1000 o, ancora meglio, di classe 100.

Ambienti in fase operativa

Sono quelli in cui è stata avviata l'attività e si svolge il lavoro che implica ingresso e spostamenti di persone e cose che vengono dall' ambiente esterno e, quindi, portano nuova contaminazione nell'aria protetta e, in precedenza, decontaminata.

Anche in questi ambienti, ovviamente, la concentrazione delle particelle deve rientrare nei limiti surriferiti per poter fare un buon lavoro. Sorge il problema di decidere quando eseguire le misurazioni della concentrazione delle particelle. Attualmente prevale la tesi di eseguire le misurazioni sia durante l'attività che alla fine del lavoro, ossia quando gli ambienti sono in fase di riposo, e di farne poi la media. Le due conte dovrebbero dare risultati abbastanza simili ma, comunque, la contaminazione, in assenza di personale, dare una concentrazione più bassa perché, certamente, la contaminazione umana è una componente importante. Infatti si sa che ogni persona può generare 1.000.000 di particelle ogni ora, e quindi far si che rapidamente si creino le condizioni che portino a superare la concentrazione limite.

Per ovviare o ridurre tale grave componente di contaminazione, il personale addetto ad operare con i macroarray, specialmente se si tratta della produzione, è bene che faccia la doccia prima di entrare nell'ambiente di lavoro e lasci fuori gli effetti personali quali orologio, gioielli, cosmetici ecc. Deve poi, in una prestanza attrezzata, indossare camici completi nel senso che comprendano in un unico pezzo anche la copertura dei piedi, dopo aver lasciato le scarpe e indossato pantofole, e del capo, e siano di polietilene o di materiale, comunque, assolutamente, chimicamente inerte. Deve inoltre coprire la bocca ed il naso con una mascherina ed infilare guanti elastici monouso e del tipo di gomma sintetica e senza polvere.

Alcuni operatori, per abbassare al minimo la concentrazione di particelle, utilizzano negli ambienti in cui già entra, a pressione, solo aria opportunamente filtrata, anche altri superfiltri portatili supplementari dotati di lamine filtranti di tipo ULPA ( ultra high efficiency particulate air ), che hanno un'efficienza del 99.999%, invece dei soliti HEPA ( high efficiency particulate air ) che hanno un' efficienza del 99.97%.

Poi è buona regola che i pavimenti, almeno ogni 30 giorni, siano lavati molto accuratamente con adatti detersivi.

Contaminazione biologica

La contaminazione biologica deriva dall'unto delle mani, da impronte digitali, capelli, saliva, lacrime, o dal rinnovo delle cellule cutanee. Tutti questi contaminanti contengono macromolecole e contaminanti di vario genere che possono compromettere la qualità della risposta dei microarray. Notiamo specialmente la presenza di lipidi, DNA, ribonucleasi ecc.

Ribadiamo, quindi, che, appena entrati e prima di iniziare a lavorare, tutte e due le mani devono essere ricoperte con guanti che è bene siano di gomma sintetica perché quelli prodotti con gomma naturale contengono alte concentrazioni di proteine vegetali che possono inquinare sia il materiale dei substrati che gli spots. Se si fanno lavori che possano danneggiare i guanti, è bene infilare due paia di guanti, l'uno sopra l'altro.

Si deve evitare in questi ambienti di fare starnuti o colpi di tosse che causano l'emissione di un elevato numero di goccioline di muco o saliva. In caso di necessità è bene che il personale abbandoni l'area a contaminazione controllata e, prima di rientrare, per riprendere il lavoro, indossi un nuovo camice ed un nuovo paio di guanti.

Contaminazione chimica

Le più comuni fonti di contaminazione chimica derivano da pitture, colle, adesivi e materiali per imballaggio. Sono anche fortemente contaminanti apparecchiature che emettano gas o vapori. Infatti bisogna tener presente che molti composti organici sono fortemente reattivi ed alcuni sono anche altamente fluorescenti.

Per le stesse ragioni il personale che lavora in questi ambienti non deve fare uso di acqua di colonia, profumi, colluttori, tutti prodotti che tendono ad evaporare facilmente. Deve essere anche proibito di introdurre cibi o masticare gomme.

Contaminazione termica

La temperatura consigliata è di 20°C, con oscillazione in eccesso o in difetto non superiore a 3°C. Questa è la temperatura che determina le migliori condizioni di lavoro per il personale e garantisce il funzionamento ottimale degli apparecchi. Inoltre bisogna tener presente che fluttuazioni maggiori possono influire sull'andamento di alcune reazioni chimiche alterandone la cinetica.

Quindi i locali adibiti a tali attività non dovrebbero contenere apparecchi come i frigoriferi, i congelatori, le centrifughe, gli agitatori che sono fonti di calore a meno che, all'atto della costruzione degli ambienti destinati a tale attività, non se ne sia tenuto conto, calcolando un adeguato rinnovo d'aria oppure non si immettano dei condizionatori ausiliari al fine di mantenere costantemente la temperatura desiderata.

Contaminazione elettrostatica

La contaminazione elettrostatica è generata da squilibri fra cariche elettriche positive e negative. Le plastiche, le gomme, il cellofan ed altri prodotti possono creare tali squilibri che possono favorire l'intrappolamento di molecole contaminanti sui microarray in fase di produzione riducendone la qualità.

Siccome nella costruzione e l'allestimento di tali ambienti a contaminazione controllata è praticamente impossibile fare a meno di tali materiali, bisogna fare in modo che il grado di umidità relativa non superi mai il 35-45%, perché, fino a questi livelli, l'umidità assorbe tali cariche prevenendone l'accumulo. Bisogna anche raccomandare al personale di non strofinare l'un l'altro questi materiali, perché, se lo si fa, si crea squilibrio di cariche.

Bisogna poi curare che, sia i substrati che i microarray completi, siano subito impacchettati in appositi sacchetti di carta argentata anti contaminazione elettrostatica. Poi bisogna raccomandare che l'apertura di queste confezioni sia fatta lentamente, aiutandosi con le forbici e mai strappando.

CONTROLLO AMBIENTALE

Abbiamo elencato le varie forme di contaminazione ambientale, che vanno tenute sotto stretto controllo, ma, per quanto riguarda questi ambienti, ci sono altri aspetti strutturali ed organizzativi anche molto importanti quali la temperatura, l'umidità relativa, l'illuminazione e l'uniformità.

Temperatura

La temperatura ideale, come abbiamo già riferito, è 20°C con oscillazioni, in più o in meno di 3°C.

Infatti questa è la temperatura più confortevole per il personale ed è il livello a cui lavorano meglio alcune apparecchiature come i robot. Il mantenere sempre la stessa temperatura è importante anche per impedire fluttuazioni nella cinetica delle reazioni chimiche.

Umidità relativa

La si valuta facendo il rapporto fra l'umidità dell'ambiente ad una data temperatura e l'umidità massima raggiungibile in quell'ambiente a quella temperatura ed a un certo livello di pressione. Per tali lavorazioni è consigliata un'umidità relativa del 40% con oscillazioni non superiori al 5%. Infatti livelli più elevati di umidità possono influire sulla cinetica di alcuni processi che richiedono una graduale disidratazione. Una fase particolare della produzione dei microarray è quella che riguarda la distribuzione per contatto delle goccioline degli spots che è bene si svolga ad un livello di umidità relativa del 55%. Per tale ragione l'area in cui si svolge tale processo, e solo quella, deve essere chiusa e condizionata per realizzare in loco le condizioni ottimali desiderate.

Una condizione opposta si deve creare quando si deve legare il DNA alle amine o alle aldeidi. Sono queste reazioni che è bene che si attuino ad un'umidità relativa inferiore al 20% e, quindi, facendo uso di una stufa a secco.

Illuminazione

Negli ambienti a contaminazione controllata bisogna anche controllare sia l'intensità che la qualità dell'illuminazione. E' consigliabile una sorgente luminosa da lampade fluorescenti sia perché producono meno calore dei bulbi incandescenti sia perché fanno una luce più bianca e fra queste bisogna preferire quelle a spettro totale che hanno un tipo di luce molto simile a quella della luce solare. Infatti se si considera uguale a 100 l'indice che esprime l'insieme delle lunghezze d'onda della luce solare, le normali lampade fluorescenti, se calde hanno un indice di 50-60, se fredde lo hanno di 60-70, quelle a spettro totale hanno un indice uguale o maggiore di 95.

Le lampade, che devono essere completamente chiuse, vanno poi disposte in modo da dare un’ illuminazione uniforme che, come intensità, deve essere circa 4 W per piede quadrato.

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CAPITOLO QUATTRO

STRUMENTI PER PRODUZIONE E LETTURA

CONSIDERAZIONI PRELIMINARI

La produzione dei microarray, per tutte le ragioni suesposte, è un tipo di lavorazione molto fine che fra l'altro utilizza materiali spesso costosi. Va, quindi, studiata molto bene per essere di qua1ità ed a costi contenuti perché possa essere utilizzata da un numero sempre maggiore di laboratori.

In linea di massima un vetrino con un gran numero di spots, ovviamente, vale di più di uno che ne contenga di meno. Oggi praticamente è possibile produrre anche singoli vetrini che contengono tutti i circa 30.000 geni umani, ma hanno, ovviamente, un costo notevole.

Si tenderà quindi a produrre microarray dedicati, nel senso che contengano solo alcune decine di spots, o anche centinaia, ma preparati per risolvere un ben preciso problema diagnostico o scientifico. Quindi la gamma dei tipi di prodotto che si potranno fare è praticamente illimitata.

Facciamo seguire le caratteristiche più importanti che tali prodotti devono avere per poi capire ed interpretare meglio i vari metodi di produzione.

Densità

E' il criterio che esprime la densità per unità di area ed è calcolata in base al numero di probes o spots per centimetro quadrato. Si misura in base alla distanza o spazio esistente fra due centri degli spots (center-to center spacing ), utilizzando la seguente formula:

D = 100x ( 1000/CTC ) 2

Questo significa che un microarray che abbia una distanza da centro a centro di 140 micron, ha una densità di 100 x ( 1000/ 140 ) 2 che è uguale a 5102 spots per cm quadrato. Così un microarray che ha 1000 targets o spots in un'area di 0,81 cm quadrati ha una densità di 1235. Comunque la densità è espressa in unità di migliaia nel senso che un vetrino o chip con 20.000 spots è riferito come 20k chip.

La densità è una caratteristica molto importante, perché, a parità di altri fattori, determina la quantità di dati che si riescono a conoscere per unità di area. Comunque ci sono microarray a bassa densità, che ovviamente sono più facili da produrre, costano meno e si leggono anche con scanner molto semplici. I microarray con densità più elevate, comprese fra 1000 e 10.000 possono essere prodotti e letti solo con macchine più sofisticate e, naturalmente, costose.

C'è poi un'altra considerazione da fare. Su molti vetrini o chips gli stessi spots sono ripetuti più volte, per poi fare la media dei risultati. Ora un 25k microarray con 1250 spots ripetuti in duplicato ha un valore maggiore di un 25k che ha 25 spots ripetuti 1000 volte.

Dimensione

E' il criterio che esprime la grandezza fisica del singolo elemento o spot il cui diametro sia espresso in micron. E' un criterio molto importante perché determina la densità.

La maggior parte delle apparecchiature, sia che lavorino a contatto o che lavorino non a contatto rilasciano elementi o spots il cui diametro medio è compreso fra 75 e 300 micron. Quelle invece, la cui tecnologia si basa sui semiconduttori, rilasciano elementi o spots di 10-40 micron. La distanza da centro a centro, per i microarray prodotti a stampo, è calcolata moltiplicando la dimensione media per un fattore 1.2-1.4. Per esempio la distanza di elementi da 110 micron è di 132-154 micron. Per i microarray preparati con fotolitografia o microspecchi gli elementi sono praticamente contigui per cui la dimensione e la distanza sono equivalenti.

Dato che più piccoli sono i singoli elementi e maggiore è la densità e quindi maggiore è il numero delle informazioni che ne possono derivare, la tecnologia è andata evolvendo verso la produzione dI microarray a più elevata densità che ha costretto a produrre lettori con poteri di risoluzione sempre più sofisticati.

Purezza.

Tale criterio si riferisce alla omogeneità delle molecole presenti in ogni spot o elemento; all'atto pratico non dovrebbe essere inferiore al 99%. La purezza è molto importante perché determina la specificità della rea:l;ione biochimica che ne deriva.

Deviazioni dal 100% possono essere causate sia da impurità sia da errori umani sia da difetti di distribuzione dovuti alle macchine. I contaminanti possono essere eliminati curando sia i metodi di purificazione sia adottando le migliori procedure di filtrazione dei materiali da usare per i target Insomma bisogna fare in modo da evitare che, al momento dell'utilizzo, le molecole del probe interagiscano con superfici imperfette, dando luogo a segnali aberranti.

Reattività

Un microarray ideale dovrebbe avere il 100% delle molecole dei probes in grado di reagire con le molecole dei targets praticamente, non è cosi. Per la maggior parte dei microarray è molto probabile che sia decisamente più bassa la percentuale delle molecole che reagiscano. Infatti la reattività può essere compromessa sia nel corso della produzione sia nelle fasi di successive manipolazioni.

Perdita di reattività dei microarray per le proteine o gli RNA può essere causata specialmente nel corso della fase di essiccamento. Le molecole di DNA risultano essere più resistenti.

Regolarità

Riguarda la regolarità delle linee e delle colonne degli elementi o spots. Si misura determinando la distanza di centro da centro ed è accettato un coefficiente di errore non superiore al 10%. Questo significa che, se per esempio la distanza di centro da centro è fissata a 140 micron, all'atto pratico ci potranno essere spots ad una distanza compresa fra 126 e 154 micron da quelli adiacenti. Queste oscillazioni, praticamente, si riverificano solo con le macchine che distribuiscono a stampo perché, quando si usano quelle che si basano sulla tecnologia dei semiconduttori, le linee e le colonne risultano essere molto regolari.

Deviazioni dalla regolarità sono in genere dovute ad irregolarità del substrato, derivanti da aree idrofobiche che determinano forze locali che causano migrazioni delle goccioline degli spots. Fenomeni analoghi, comunque, possono essere causati anche da vibrazioni delle macchine che distribuiscono gli spots o anche correnti d'aria nell' ambiente in cui operano.

Microarray irregolari rendono difficile la lettura da parte degli scanner e sono causa di grossolani errori.

Facilità d'uso

E' molto importante realizzare prodotti che siano facilmente utilizzabili sin dal primo momento anche da personale di laboratorio che non abbia ancora un'esperienza specifica. Si tratta di un aspetto pratico non trascurabile perché può avere un impatto commerciale tale da determinare il successo o meno del prodotto.

Rendimento

E', naturalmente un aspetto molto importante delle macchine addette alla produzione ed esprime la velocità, in un determinato tempo, con la quale queste riescono ad espletare tutti i passaggi che sono necessari per condurre a termine le varie fasi di produzione dei microarray sia anonimi che dedicati.

MACCHINE PER LA PRODUZIONE

Descrivere le macchine che si utilizzano per produrre i microarray esce un po' fuori dai limiti e dagli intendimenti di questa sintetica monografIa. Tuttavia riteniamo che possa essere utile averne un'idea. Se ne distinguono tre tipi: Macchine da contatto; macchine che non richiedono contatto e macchine fotolitografiche.

Macchine da contatto

E' questo il tipo di tecnologia più tradizionale ed è quello ancora più largamente utilizzato specialmente da parte dei ricercatori. Si tratta di un gruppo abbastanza articolato perché sono presenti sul mercato vari modelli che si differenziano principalmente per il tipo di gocciolatore o meglio di spillo o pin.

C'è il modello cosi detto " pin and ring " ossia spillo e anello, caratterizzato appunto da un pin che fuori esce da un microanello che lo circonda e dall'interspazio per capillarità scende lo spot che si deposita per contatto sul vetrino.

Un altro modello di pin, " il micro spotting "che è forse il più noto, è quello che contiene un sottilissimo canale verticale centrale che rende possibile la deposizione, per semplice tensione superficiale, di microgocce omogenee, il cui volume, in base al diametro del canale può essere regolato fra 0,25 e 0,60 microlitri e che hanno un coefficiente di variazione sempre inferiore al 10%.

Un altro modello ancora è lo " split pin" o spillo spaccato, che ha le caratteristiche di una pinzetta fra le cui branche il liquido si ferma per la formazione di un menisco e poi viene espulso sul vetrino.

Altre macchine ancora utilizzano dei semplici tubi capillari che rilasciano lo spot per semplice contatto. Questo sistema permette di fare un ottimo lavoro ma la pulizia e la manutenzione fra i cicli di lavoro risultano difficili da attuare.

Macchine che non richiedono contatto

Hanno qualcosa di simile alle stampanti a colori a getto d'inchiostro in quanto utilizzano un sistema piezoelettrico che si basa sulla proprietà che hanno dei cristalli di ceramica, inseriti in tubicini flessibili, di deformarsi per il passaggio della corrente, permettendo cosi la deposizione di goccioline calibrate.

Questa tecnologia è utilizzata anche quando si voglia realizzare direttamente sul vetrino la sintesi di oligonucleotidi. Si usano in questo caso macchine dotate di quattro dispensatori che lavorano in parallelo dispensando ognuno una delle quattro basi in base alla sequenza desiderata. Altre macchine dispensatrici di questo tipo usano lo stesso principio delle stampanti della giapponese Canon che, semplicemente innalzando la temperatura del liquido, lo rendono meno viscoso permettendone la discesa sul vetrino.

Fotolitografia

Utilizza un tipo di microtecnologia simile a quella che viene utilizzata per la produzione dei chip dei computer e permette di realizzare direttamente sul supporto solido la sintesi fotochimica ordinata e precisa di qualsiasi tipo di oligonucleotide di tipo corto, ossia non superiore a 30 nucleotidi. Particolari maschere fotolitografiche al cromo rendono possibile per frazioni di secondo il passaggio o meno di raggi ultravioletti che colpiscono le microaree dove si realizzano le sintesi. Si usano vetrini trattati sia con silani, che rendono la superficie attiva verso i gruppi amminici, che di un altro prodotto fotorimovibile noto come MeNOPC ossia 5’ ( alfa metil-6-nitropiperoniloxicarbonil ) che è neutralizzato selettivamente e temporaneamente appena esposto ai raggi ultravioletti. L'attivazione o meno rende possibile il legame progressivo fra i vari nucleotidi rendendo possibile la formazione progressiva del nascente oligonucleotide.

Ovviamente questa tecnologia può essere usata solo per monitorare l'espressione genica, l'analisi dei polimorfismi, l'analisi delle mutazioni geniche ed il sequenziamento del DNA.

CONTROLLO DI QUALITA’ DEGLI SPOTS

La distribuzione degli spots è indubbiamente una delle fasi più delicate della produzione dei microarray per cui il controllo di qualità è una fase molto importante del processo. Le varie compagnie commerciali hanno risolto i problemi in vario modo, sfruttando l’esperienza accumulata negli ultimi anni. Ma, malgrado l’uso di robot, sempre più sofisticati, si ha un coefficiente di variabilità degli spots che oscilla fra lo 0 ed il 22% ed un C.V. medio del 6,8%.

Quando si esgue la produzione dei microarray, e più esattamente, quando si utilizzano le macchine che fanno lo “ spots printing ”, ovvero si depositano sui vetrini le goccioline o spots dei probes, possono sorgere diversi problemi. Occasionalmente la morfologia degli spots può risultare decisamente alterata nel senso che si verificano delle sbavature perché il gocciolatore o pin è difettoso e lo si può constatare osservandolo al microscopio. Altri ricercatori hanno avuto problemi analoghi di alterata morfologia degli spots per disturbi di tensione che si possono verificare sulle superfici dei vetrini specialmente quando si adoperano tamponi a base di fosfati. Se si fa uso di tamponi a base di SSC, tali inconvenienti non si verificano.

Altro aspetto della tecnologia che bisogna curare per avere degli spots omogenei, è un adeguato volume di campione presente nei pozzetti in cui il pin va a pescare prima di depositare sui vetrini le goccioline o spots.

Un altro inconveniente che, talvolta si può verificare è che il DNA non si fissi bene sul vetrino per cui durante la fase di ibridazione, venga lavato via. Dopo aver esguito la distribuzione degli spots, un controllo molto semplice lo si può fare alitando sul vetrino in modo da formare sulla superfice un sottile strato di vapore. Gli spots dove il DNA si è legato appaiono più chiari. Altri preferiscono controllare il vetrino sotto il microscopio.

Ma un metodo tecnicamente più corretto per valutare il lavoro fatto, che è da molti adottato, è quello di colorare qualche vetrino con un colore fluorescente. Il più usato per tale genere di controllo è il SybrGold della Molecular Probes. Dop il lavaggio si fa il controllo con uno scanner al laser che permette di valutare sia la morfologia che la quantità di DNA degli spots. Il vantaggio di usare il SybrGold è dato dal fatto che, essendo un colorante non molto invasivo, i vetrini si possono riusare. Quando si deve valutare l’attività dei geni, si possono, a tal fine, inserire più geni per ogni singolo spot e poi, decodificando l’espressione con metodi matematici, capire se il processo di distribuzione è stato realizzato con una variabilità accettabile ( Khan et al. 2003).

MACCHINE PER L’AUTOMAZIONE DELL’IBRIDAZIONE

Il principio base dell’automazione sui microarray è lo stesso del Southern e del Nothern bllotting con la differenza che i probes sono immobilizzati sul vetrino mentre lo RNA cellulare è in fase liquida per cui alcuni hanno denominato i microarray “ reversed phase Southern or Northern blotting assays”.

Molti ricercatori eseguono ancora manualmente l’ibridazione ma è una manualità che richiede un buon livello tecnico e molta pazienza. Inoltre, dato che i volumi dei target sono molto piccoli così facendo, spesso succede che non si realizzi l’incontro con il probe o che, data la lentezza delle procedure si comincino ad asciugare i bordi, il che ha poi come conseguenza che si determini un aumento del rumore di fondo che poi disturba la lettura finale.

D’altro canto il numero dei potenziali utilizzatori dei vetrini da spottare è in rapido aumento, come sta crescendo, molto rapidamente, il numero delle possibili applicazioni.

Diverse aziende stanno quindi tentando di mettere a punto delle apparecchiature automatiche per l’ibridazione con la speranza di ottenere risultati migliori di quelli ottenibili manualmente. Le difficoltà da superare non sono poche e questo spiega perché non ci sembra che il problema sia stato convenientemente risolto. In base a quanto viene riportato dalla letteratura, uno dei tentativi meglio riusciti è la stazione d’ibridazione messa in commercio dalla Vantana Medical Systems di Tucson ( Arizona).

STRUMENTI PER LA LETTURA

Schena, giustamente, sentenzia: Gli strumenti per la lettura dei microarray stanno rivoluzionando la biologia.

Infatti queste meravigliose macchine possono leggere, in pochi minuti, in automazione, una quantità tale di dati che le tecnologie usate prima avrebbero richiesto mesi o anni per fare lo stesso lavoro.

Quindi in questo capitolo passeremo in preliminare rassegna i sistemi, le tecnologie, i tipi di segnali, i criteri d'interpretazione e tutto quanto riguarda la lettura dei microarray.

Infatti è questa una fase altamente critica perché nel singolo microarray, attraverso l'immagine, che è praticamente una fotografia. bisogna discernere un gran numero di risultati. Vediamo quindi quali sono i criteri che ci permettono di valutare tutti gli aspetti che concorrono alla lettura e alla interpretazione dei dati.

Sistemi di lettura

Sono praticamente due i tipi di macchine più largamente utilizzate per la lettura dei microarray: gli scanners e gli imagers.

Gli scanners, attualmente più largamente usati, sono macchine che catturano l'intera immagine muovendo l'ottica o il vetrino con piccoli scatti regolari di 10 micron in orizzontale o in verticale. La maggior parte di queste macchine usa come fonte luminosa di eccitazione quella di un laser con appropriati filtri, ed un fotomoltiplicatore per catturare l'immagine.

Gli imagers leggono progressivamente, e con movimenti regolari, aree dei vetrini di 1 cm² e poi combinano tutta l' immagine per esprimere l'insieme dei dati leggibili. Utilizzano luce bianca per l'eccitazione ed un CCD (charge-coupled device) per catturare l'immagine.

Velocità

E' la velocità alla quale il robot di lettura riesce a leggere l'area del vetrino ad un dato livello di risoluzione e si esprime in cm² / minuto. I primi prototipi di scanner erano in grado di leggere un area di 50 mm² /minuto ad una risoluzione di l0 micron. Gli scanner attuali riescono a leggere ad una velocità di 300, ed alcuni anche 500 mm² / minuto, sempre ad una risoluzione di 10 micron.

Comunque, alla velocità di 300 mm² / minuto, un intero vetrino di 20x 72 mm, che può contenere anche più di 10.000 geni, viene letto in 5 minuti.

Precisione

Un ideale mezzo di lettura dovrebbe essere in grado di leggere una stessa immagine di un microarray più volte con l'identico risultato. In genere, invece ci sono delle variazioni derivanti sia da imprecisioni meccaniche sia da fluttuazioni della forza di eccitazione della sorgente luminosa o del detector.

Il criterio della precisione esprime, appunto, l'ampiezza della deviazione della capacità di lettura che non dovrebbe superare il ± 10%

Ripetibilità

Esprime la capacità dello scanner a ripetere più volte la lettura di una stessa immagine senza deviare minimamente né in senso orizzontale né in senso verticale. E’ tollerata una possibilità di errore non superiore al 2%. Comunque bisogna tener presente che se la qualità del microarray lascia a desiderare, anche questo aspetto può compromettere la ripetibilità della lettura da parte degli scanner.

I sistemi di lettura con imagers, che utilizzano un posizionamento fisso del vetrino ed un'ottica fissa. sono, sotto questo profilo, più affidabili.

Risoluzione

Il potere di risoluzione si esprime in pixel, che è la misura bidimensionale di un’ immagine, conservata in formato digitale, riportata sullo schermo di un computer. Si tratta quindi di un'area quadrata misurata in micron. Maggiore è il numero dei pixel e maggiore è il potere di risoluzione ossia la capacità ad ingrandire un'immagine senza alterarla ovvero farla apparire granulosa.

I primi sistemi di lettura arrivavano al massimo ad un livello di risoluzione di 10-20 micron, quelli attuali arrivano a dare immagini nette anche a livello di 3 micron.

Un potere di risoluzione che arrivi a 10 micron corrisponde a 10.000 pixels ( 100x100 ) per mm².

Ampiezza di segnale

L'ampiezza della capacità di segnale di un certo sistema di lettura è rappresentato dal quoziente fra il valore ottenibile più alto ed il più basso, che, in questo caso, in genere è di circa 1000 volte. Infatti a 16 bit l'ampiezza di segnale, in numeri assoluti va da 66 a 65,536. Riducendo il rumore di fondo alla metà, l'ampiezza può arrivare a 2000 volte, ossia passare da 33 a 65,536.

Ma dato che, in alcuni esperimenti l'ampiezza di espressione genica può arrivare anche a differenze di 100.000 volte, si cerca di potenziare l’ ampiezza di lettura dello strumento modificando il potere del laser o l'intensità della luce in modo da fare più letture a livelli diversi di sensibilità.

Sensibilità

Esprime la capacità di un sistema di lettura di convertire i fotoni fluorescenti del microarray in segnale elettronico. Può essere portata al massimo agendo sul fotomoltiplicatore.

Capacità di discernimento

Dato che molti geni umani hanno bassissimi livelli di espressione, è molto importante poter operare con sistemi di lettura in grado di apprezzare anche segnali tanto deboli che non sia facile apprezzante la differenza rispetto al rumore di fondo.

Dato che il più comune sistema, che si adopera, si basa sulla fluorescenza, che si esprime in numero di molecole fluorescenti ( fluors ) che si riesce ad apprezzare, anche la capacità di discernimento viene espressa in fluor per micron quadrato.

I primi sistemi di lettura avevano una capacità di discernimento di 1 fluor per micron quadrato ma i più moderni arrivano a 0.01 fluor per micron quadrato.

Dato che il rumore di fondo dipende in gran parte dal substrato, negli ultimi anni si è fatto molto lavoro per ridurre al massimo la fluorescenza di fondo che è aspecifica. Così si è riusciti ad apprezzare segnali specifici anche a concentrazioni 10 volte più basse.

Uniformità

La valutazione preliminare della uniformità di segnale in tutte le aree del vetrino ricoperto dal substrato è un criterio molto importante perché ci garantisce poi la specificità e la correttezza delle letture quando la partita verrà utilizzata per le analisi. Dato che non esistono substrati perfetti. è accettata una non uniformità che non ecceda il 10% per aree di 5x5 mm.

Per eseguire la misurazione dell'uniformità si esegue la prova dei 180 gradi: Si passa sotto lo scanner un'area di 10x22 mm e, se si nota l'esistenza di un gradiente, si rimuove il vetrino con il substrato da sotto allo scanner, lo si ruota di 180 gradi e si legge di nuovo la stessa area. Se il gradiente delle due letture ha la stessa forma, la non uniformità è dovuta allo scanner. Se invece il gradiente, nelle due misurazioni, prende forme opposte, la non uniformità è attribuibile al substrato.

Quando la non uniformità di lettura è dovuta allo scanner, questo può dipendere sia da variazione di eccitazione della sorgente luminosa che da problemi concernenti la distanza focale della lente.

Sono due difetti che, se sono presenti nel sistema, vanno corretti preventivamente.

Numero di canali

I primi scanner artigianali usati per la lettura dei microarray avevano un solo canale e quindi potevano leggere ad un'unica lunghezza d'onda. Poi sono stati costruiti strumenti che potevano leggere contemporaneamente due microarray, in cui uno funzionava da controllo. La maggior parte degli strumenti attuali hanno tre canali, di cui due sono utilizzati per leggere in parallelo due campioni diversi, mentre il terzo canale serve per leggere in simultanea il controllo.

Ci sono poi strumenti dedicati a particolari applicazioni anche a cinque canali per la lettura, per esempio del DNA . Di questi, quattro servono per leggere, ciascuno una delle quattro basi, mentre il quinto canale serve per il controllo.

Ci sono poi strumenti che hanno più canali per leggere a lunghezze d'onda diverse, nell'ambito dello spettro visibile, compreso fra 400 e 700 nm, con frequenze di emissione che devono essere di almeno 50 nm fra un livello di segnale e l'altro.

Sovrapposizioni

In alcuni strumenti, per questo aspetto difettosi, ed in particolari condizioni sperimentali, può succedere che il segnale fluorescente di un canale si mescoli con quello di un altro canale, fenomeno indesiderato che gli anglo-americani chiamano " Cross- Talk ".

E' un fenomeno che, naturalmente, porta a letture errate, perché succede che le letture di due canali si sommino, creando non pochi problemi di interpretazione. Per gli scanner tale fenomeno lo si riesce a minimizzare scegliendo bene il tipo di laser o intervenendo sui filtri di emissione. Per gli imagers, che utilizzano la luce bianca, la correzione risulta più problematica.

Degrado del campione

I campioni fluorescenti, nelle fasi di lettura, possono andare incontro a fenomeni di degrado in cui le molecole fluorescenti sono danneggiate da un'eccessiva esposizione alla luce, per cui letture. eseguite in tempi diversi, possono dare risultati non sovrapponibili.

Questo inconveniente, che era abbastanza frequente con i primi prototipi di scanner, in cui si arrivava a sbalzi anche del 200-300%, con gli strumenti moderni, raramente si arriva al 10%. Comunque. per minimizzare gli inconvenienti delle false letture, è buona regola leggere sempre con un livello di illuminazione il più basso possibile.

Ampiezza dell'area

Dato che ogni produttore stampa i vetrini o i supporti di misure diverse e con una diversa configurazione, è bene preferire sistemi di lettura che coprano simultaneamente un'area quanto più ampia. Raccomandabili sono gli scanners che leggono, in un unico insieme, un'area di 25x76 mm, che equivale all'intera superficie del vetrino portaoggetti standard.

Dimensioni

Le dimensioni complessive dei primi strumenti di lettura erano di circa 180x 90x30 cm e pesavano anche più di 200 kg. Quelli attuali sono circa 30x60x30cm e pesano 15-40 kg. Tanto che alcuni sono addirittura portatili.

Ovviamente si tende quindi a renderli sempre più maneggevoli

SEGNALE E RUMORE

In tutti gli esperimenti in cui si utilizzano microarray con acidi nucleici o proeine, in cui si è costretti a fissare materiali biologici su supporti solidi e cosguentemente ibridare o legare comunque altre molecole,bisogna essere in grado di gestire correttamente una grande quantità di fasi tecniche che si devono affrontare sia prima che dopo l’eperimento vero e proprio, Di particolare importanza è la gestione e interpretazione del segnale che che può essere influenzato da moltissimi fattori. Intanto dobbiamo chiarire cosa intendiamo per segnale e cosa. invece è il rumore.

Il segnale è l'espressione numerica di lettura che corrisponde al vero dato sperimentale.

Il rumore, invece, è dato dalla somma delle interferenze aspecifiche, che disturbano la lettura del segnale, e che, come in seguito riportiamo, possono avere origini diverse. Il quoziente segnale/ rumore è molto importante. Infatti, in tutti gli esperimenti bisogna fare in modo, per ovvie ragioni, che sia quanto più alto.

Componenti del segnale

Sono tre le componenti determinanti del segnale che si evidenziano a conclusione di un' analisi: La componente intrinseca, la estrinseca e la quantità.

La componente intrinseca deriva direttamente dalle proprietà del tracciante fluorescente scelto da legare al target, dalla concentrazione e dal suo coefficiente di estinzione. L'accurata selezione del tracciante fluorescente ha quindi una grandissima importanza.

La componente estrinseca deriva da una serie di fattori legati allo strumento di lettura come il tipo di sorgente luminosa, la lunghezza d'onda, il tempo di esposizione ecc. Ma deriva anche da fattori ambientati come la polarità del solvente, il pH del tampone ecc. Si può avere anche un decadimento del segnale quando gli spots non sono perfettamente allineati per cui si può verificare un trasferimento di energia da uno all'altro (self- quenching).

Ovviamente il terzo determinante del segnale deriva dalla quantità ovvero dal numero delle molecole sia del target che del tracciante ma fra questi due componenti non c'è mai un rapporto 1:1. E' sempre compito del ricercatore trovare sperimentalmente il rapporto preciso che esalti al massimo il segnale.

Per quanto riguarda le proteine non si deve dimenticare che talvolta, trattandosi di molecole instabili si può arrivare a risultati in tutto o in parte inutilizzabili.

Componenti del rumore

Sono numerose anche le componenti del rumore che riguardano sia lo strumento di lettura che il vetrino o fase solida.

Rumore derivante dallo strumento

Lo strumento può creare problemi se si verificano cali di tensione ( dark current ) che sono causati prevalentemente da sorgenti di calore. Questa è la ragione per la quale la camera di lettura del CCD di molti imagers è tenuta a-50° C. Altra fonte di rumore può essere dovuta ad un disturbo elettronico del circuito, dell' amplificatore o del convertitore analogico-digitale.

Rumore può anche essere causato da inconvenienti del sistema ottico innescati da anomali riflessi di luce del substrato o da raggi cosmici.

Rumore derivante dal microarray

La maggior parte dei microarray hanno come fase solida il vetro e, quindi, questo stesso materiale, se non ben scelto, può essere fonte di rumore. Lo stesso fenomeno può derivare da non appropriati componenti del substrato stratificato sul vetro. Qualora la fase solida sia in plastica o abbia dei componenti metallici, il pericolo che si evidenzino interferenze da rumore è più probabile. Comunque trattamenti delle superfici con gel o nitrocellulosa sono causa di un rumore molto più accentuato di quello che si ha per trattamenti con organoamine o organoaldeidi di alta qualità.

Così anche alcune molecole del diluente del campione o lo stesso campione possono reagire in modo aspecifico con il substrato provocando interazioni che oscurano parzialmente il segnale. Questo tipo di rumore è ben noto come " rumore di fondo ". Molto lavoro è stato fatto negli ultimi anni per ridurre al minimo queste interferenze e, quindi, oggi i sistemi di lettura sono stati cosi perfezionati, che è possibile leggere agevolmente anche segnali di poche dozzine di molecole dei singoli spot.

Abbiamo anche già richiamato l’attenzione sul fatto che i microarray possono essere contaminati da particelle di polvere flottanti nell’aria per cui in fase di lettura si notano dei falsi spots molto chiari che rendono difficile la finale interpretazione dei risultati. E’ quidi di fondamentale importanza operare, sia in fase di produzione che di utilizzazione in ambieti in cui la concentrazione delle particelle sia molto bassa e gli operatori indossino camici completi

LA FLUORESCENZA

La fluorescenza è il tipo di segnale luminoso più comunemente usato nella lettura dei microarray.

Vale quindi la pena di approfondire come si collochi lo spettro della luce visibile nell'ambito delle radiazioni elettromagnetiche.

Le radiazioni elettromagnetiche vanno da un minimo di lunghezza d'onda di 10^-3 nm, dei raggi gamma ad un massimo di 10¹² nm delle onde radio, come riportato nello schema che segue: luce visibile.

raggi gamma

raggi x

ultravioletto

infrarosso

microonde

televisione

radio

10^-3

10^-2

10^-1

10¹

10 ²

10 ³

10 ⁴

10⁵

10 ⁶

10 ⁷

10 ⁸

10 ⁹

10 ¹⁰

10 ¹¹

10 ¹²

lunghezze d'onda in nanometri

In questo ampissimo ambito, di ben 15 ordini di grandezza, in cui si inquadrano progressivamente, in base alla lunghezza d'onda, a partire dai raggi gamma a cui seguono i raggi x, i raggi ultravioletti, la luce visibile, i raggi infrarossi, le microonde, le onde per la te

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